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如果您选择的示踪剂是亲脂性染料并且用甲醇固定,脂质会随着甲醇流失。如果您使用甲醇固定,可以选择能够共价结合神经元内的蛋白质的示踪剂。
由于这些染料插入脂质膜,任何对膜的破坏都将导致染料流失。这包括用Triton X-100之类的去垢剂或是甲醇之类的有机溶剂通透。通透是胞内抗体标记所必需的,但它会导致染料流失。相反,CFDA SE之类活性染料能够共价连接到细胞组分,因此可以在固定和通透之后更好的保留。
DiI是一种亲脂性染料,多数保留在细胞脂质内。当细胞经去垢剂通透或是用乙醇固定时,会去除掉脂质和染料。如果需要通透,可以使用CM-DiI标记,因为CM-DiI会共价结合膜里面的蛋白;部分信号会随着固定/通透丢失,但残留的信号仍足以被检测出。
转运过程相当缓慢:在活体组织中大约6 mm/天,在固定组织中更慢。亲脂性羰花青示踪剂从开始给样处扩散到神经元末端,可能需要数天甚至数周的时间。FAST DIO和DiI类似物(具有不饱和烷基尾)可以提高50%左右的转运速度。
请选择与您现有的激发光源和发射滤光片组/通道兼容的染料。固体、糊和晶体形式的染料可直接施加到组织中的神经元。如需标记培养的细胞或进行显微注射,可采用溶液或固态形式的亲脂性染料。