NT-GFP Fusion TOPO™ 表达试剂盒

pBlue-TOPO中的lacZ报告基因上游隐含了一个原核启动子，通过X-Gal平板进行筛选时，大肠杆菌的转化子会呈现浅蓝色。因此，我们不推荐用户使用pBlue-TOPO来评估大肠杆菌中的启动子功能。不过，pGlow-TOPO适用于此类研究。请注意pBlue-TOPO载体中β-半乳糖苷酶的背景表达不会出现于哺乳动物细胞中。

是的，我们提供pBlue-TOPO和pGlow-TOPO载体，目的基因的DNA序列能够轻松插入到β-半乳糖苷酶或Cycle 3 GFP基因上游。

pBlue-TOPO是进行低转录活性启动子功能分析的理想载体，，因为β-半乳糖苷酶检测实验易于操作，且可以在非常低的表达水平下进行定量。pGlow-TOPO是在天然活体细胞中针对启动子元件开展非侵入性分析的理想之选。在使用带有野生型GFP滤光片组的显微镜，或荧光激活的细胞分选法的过程中，Cycle 3 GFP的荧光性质能够满足几乎任何细胞类型或物种的体内检测需求。

我们推荐在进行β-半乳糖苷酶染色前观察GFP荧光。这是因为β-半乳糖苷酶染色过程会产生非常高的自发荧光，从而干扰GFP荧光的检测。 

Cycle 3 GFP的荧光可通过适用于野生型GFP的滤光片组来完成检测（因为它们具有相同的荧光光谱）。在内部实验中，我们一般使用Omega Optical公司所提供的XF76滤光片组。Cycle 3 GFP的激发光谱为395 nm，发射光谱为507 nm。您也可对发射光谱进行观察，并记录200-800 nm处的发射情况。

Cycle 3 GFP的荧光可通过具有适当滤光片和截止波长的任意种类的荧光分析仪器进行定量。在内部实验中，我们一般使用Hitachi F-2000荧光分光光度计。我们应用此仪器的常规方案如下：

使用PBS稀释样本（也可使用Tris缓冲液或水）。裂解液的用量需要基于GFP的浓度来进行调整。这一用量一般是根据经验来确定的。第一个需要考虑的是样本浓度应处于荧光分析仪器的线性区间。我们在一个比色皿（已添加1ml PBS）中应使用5-50 µL的样本量。如需对这些读值进行分析比较，则最好能够将裂解液的用量按照转染效率和总蛋白浓度进行归一化运算，以帮助获得最为稳定的结果。

EmGFP，YFP，CFP和BFP均可通过标准的FITC滤光片组和参数设定来进行检测。不过，如需获得荧光信号的最佳检测结果，我们推荐用户针对每一种荧光蛋白的激发与发射波长范围来优化滤光片组。推荐的滤光片组如下所述：

EmGFP：Omega滤光片组XF100

YFP:Omega滤光片组XF1042
Chroma滤光片组41028

CFP:Omega滤光片组XF114
Chroma滤光片组31044

BFP:Omega滤光片组XF10
Chroma滤光片组31021

如需索取滤光片组的相关信息，请直接联系Omega Optical公司（www.omegafilters.com）或Chroma 技术公司（www.chroma.com）。