磷酸钙转染试剂盒

我们推荐您尝试使用电转法来转染您感兴趣的质粒进入细胞。我们提供Neon转染系统来帮助用户高效地转染原代细胞、干细胞以及一些难以转染的细胞。

您也可尝试使用病毒系统(https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/protein-expression/mammalian-expression/viral-expression.html?icid=fr-viral-main%20http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/protein-expression/mammalian-expression/viral-expression.html?icid=fr-viral-main)来转导您研究的基因进入到您感兴趣的哺乳动物细胞系中。

剂量反应曲线是一种测定细胞接触不同浓度抗生素时的细胞毒性的有力工具。筛选抗性细胞所需的选择性抗生素的量因多种因素而异，包括细胞类型和抗生素类型。我们建议每次制作剂量-反应曲线时使用新的抗生素（或不同的品牌）或是使用不同的细胞系。
剂量-反应曲线测定的实验概要：

1. 将细胞铺在一定数目的孔中，使得它们有25-30％的汇合度。这表明细胞仍在分裂，并对抗生素反应良好。
2. 使用生长培养基稀释待测抗生素至推荐范围的广泛线性浓度。
3. 从细胞中移去生长培养基。将含抗生素的培养基加到各自孔中，留一组孔空置不加。在这些空孔中加入不含抗生素的生长培养基。
4. 在适当的生长条件下培养细胞（每隔3-4天更换一次培养基以去除死细胞，同时添加新鲜的含抗生素培养基）并每日观察细胞状态。在10-14天时，估算每孔中的活细胞数目。（这个时间周期取决于待测抗生素。抗生素如Geneticin、Hygromycin和Zeocin需要大约3周杀死细胞，因此等待10-14天较为理想。而Blasticidin杀死细胞需要大约2周，等待7-10天即可。）为了达到这一点，移去培养基，用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞并用0.5％的亚甲基蓝和50％甲醇进行细胞染色20分钟。
5. 将对应于不同抗生素浓度的活细胞数目绘图。这个曲线即是剂量-响应曲线或致死曲线。抗生素在所选时间段内杀死所有细胞的最低浓度就是接下来用于稳定筛选的浓度。

转染无法用于某些细胞类型，例如非分裂细胞，而病毒转导既能用于分裂细胞又能用于非分裂细胞，比如难以转染的神经细胞。

脂质体介导的转染的主要优势是能取得更高的转染效率，即使是不能使用磷酸钙介导转染的细胞类型。此外，脂质体介导的转染不仅能用于寡聚核苷酸到大DNA范围内的DNA递送，还能递送RNA和蛋白质。

对于瞬时转染，转染的DNA没有整合到宿主基因组中，所以外源DNA在后续的细胞有丝分裂阶段将丢失。外源基因的表达是短暂的（最长7-10天），但表达水平很高，因为在同一个细胞里会有多个拷贝的DNA。对于稳定转染，转染的DNA能够整合到宿主基因组，因此转染细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留转染的DNA。外源基因也会随着筛选过程而表达。由于每个细胞中只整合了1-2个DNA拷贝，所以表达水平较低。稳定转染的转染效率只有瞬时转染的1-10％。