测序用 GeneRacer™ 试剂盒（含 AMV RT）和 TOPO TA Cloning™ 试剂盒

取10-20个克隆集落进行分析，以确认分离出了最长的转录本。很多基因并不仅含有一套转录起始位点，而是有多个转录起始位点，而且这些位点有时候只跨几个碱基，有些时候可能跨上百个甚至更多个碱基。对RACE产物进行克隆，同时分析多个克隆集落，可确保您能够检测出您的基因中的多种异质性转录起始位点。此外，您可能得到非全长基因转录本的PCR产物。之所以可能会获得非全长信使RNA的PCR产物，是因为：

•CIP反应之后RNA降解，而形成了带有5’端磷酸基团的非全长RNA，进而得以连接到 GeneRacer RNA寡核苷酸上。请务必谨慎处理，以确保RNA不会降解。
•CIP去磷酸化不完全。请通过增加CIP的用量，或减少RNA量来解决。
•PCR反应出现了PCR非特异性条带，未能得到真正的连接产物。请采用上述优化您的PCR条件。

形成RACE PCR假象或者非特异性的PCR条带的原因可能有如下几条：

•GSP与其它cDNA非特异性结合，从而造成非相关的产物和所需的产物一同扩增。
•GeneRacer引物与cDNA非特异性结合，从而形成了两端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
•RNA降解。
•PCR管或试剂被污染。

注：假象可能由于未处在最佳的PCR反应条件造成，此类情况可通过阴性对照PCR鉴定出来。

请看下面的原因和建议：

-基因组DNA污染或者存在未知的剪切体： 采用扩增级DNase I（货号18068015）预处理RNA。设计退火到内含子两侧的外显子序列的引物，或者退火到mRNA的外显子/外显子边界处的序列的引物，以便区分扩增的cDNA和潜在的污染物基因组DNA。如需检测产物是否来自于DNA，设置一组不进行反转录的RNA对照组进行PCR。
-引物非特异性退火： 改变PCR的退火条件。使用热启动PCR聚合酶。针对各种模板和引物组合优化镁离子浓度。
-引物形成二聚体： 设计3′ 端不含互补序列的引物。

以下列出了各种原因和我们提供的建议：

-第一链cDNA合成过程中出错：请采用优质RNA作为对照，验证第一链反应的效率。
-存在RNase污染： 向样品中添加对照RNA，以判定在第一链反应体系中是否存在RNase。您可在第一链反应体系中使用RNase抑制剂。
-RNA出现多糖共沉淀： 采用氯化锂沉淀RNA，以便去除多糖，详见Sambrook等人所述。
-靶标mRNA含有较强的转录停顿因子： 在第一链合成中，使用随机六聚体引物替代oligo(dT)，提高温度，使用靠近靶标cDNA 3′末端的PCR引物。
-PCR使用的第一链产物过少： 在50 mL PCR反应之中，至多可使用10%的第一链反应产物
-第一链合成时使用了基因特异性引物： 可以试试其他的基因特异性引物，或者改用 oligo(dT)。请确保GSP为反义序列。
-存在反转录酶抑制剂： 可在第一链反应之前，通过对mRNA进行乙醇沉淀来去除抑制剂。可以使用70%（体积比）乙醇洗涤mRNA沉淀。注：反转录酶抑制剂包括SDS、EDAT、胍盐、甲酰胺、焦磷酸钠和亚精胺。 -RNA已降解： 确认使用高质量和完整的RNA。
-退火温度过高： 视必要降低温度和/或使用降落PCR。

3′端RACE利用了mRNA中自带的poly(A)尾作为通用的PCR反应的起始位点。在这一操作步骤中，mRNA通过反转录酶(RT)和oligo-dT接头引物反转录成cDNA。特异性的cDNA随后通过PCR反应，采用基因特异性引物（GSP，退火到已知外显子序列的区域）和接头引物（靶向poly(A)尾区域）进行扩增。这样一来，即可捕获处于外显子和poly(A)尾之间的未知的3′-mRNA序列。