SeqStudio 基因分析仪应用

基因组编辑技术（包括 CRISPR-Cas9 介导的编辑）正迅速为大多数生命科学研究人员所掌握，并有望革新所有生物学与医疗卫生领域。赛默飞提供完成基因组编辑项目所需的全部工具。作为此类项目的重要组成部分，SeqStudio 基因分析仪的特性便于进行Sanger测序分析，并能很好地融入基因组编辑的工作流程。尤其是所得数据可与 Tracking of Indels by Decomposition (TIDE，中文译名：通过分解法追踪插入缺失) 软件兼容。TIDE 是一种广泛使用的用于分析基因组编辑事件效率的工具。

 白皮书：用于基因组编辑工作流程的遗传分析工具
网络研讨会：由赛默飞世尔科技产品组合解决方案助力实现的基因编辑工作流程

通过从经编辑以在 HPRT 或 relA 基因位点附近的靶区引入随机缺失的 HEK293 细胞中获取全细胞裂解液，展示了 SeqStudio 基因分析仪在基因组编辑项目中的适用性。为确认编辑位点，已将Sanger测序痕迹上传至云端，并使用 Sanger Variant Analysis 模块进行分析（图 1）。注意，编辑位点被清晰标示，可通过断点下游出现的大量混合碱基峰来观察。通过使用 TIDE 软件分析这些测序痕迹文件，确定了该混合原代培养物中编辑的效率。在每个实例中，正向和反向产生的数据所显示的删除谱系和各位点的删除频率几乎一致（图 2）。这些频率结果与采用 Invitrogen TOPO 进行克隆并对同一编辑细胞群体进行Sanger测序所得的结果相一致。

Figure 1. Analysis of genome-edited samples using the SeqStudio instrument. A mixed population of cells with a genome editing event at the human HPRT locus was analyzed using the cloud-enabled Sanger Variant Analysis app. Note that this app finds single-nucleotide variants common to both forward and reverse strands, but is also able to detect where the genome cleavage event occurred, producing a population of mixed sequences downstream (to the right in this example) of the breakpoint.

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Figure 2. 使用 TIDE 软件分析在 HPRT 和 relA 位点发生的两种不同基因组编辑事件，所用的混合群体测序痕迹由 SeqStudio 仪器生成。柱状图显示具有所示碱基缺失或插入数量的群体所占比例。对于 (A) HPRT，编辑的总体效率约为 80%；而在 (B) relA 位点，总体效率约为 20%。

在 CpG 二核苷酸序列中，胞嘧啶碱基第 5 位碳（5-meC）是否发生甲基化，是高等真核生物细胞和发育过程的关键表观遗传调控因子。因此，人们高度关注与癌症及其他病理相关的 DNA 甲基化模式变化的分析。由此发现了许多基因组区域和特定位点，在这些区域中 CpG 甲基化的存在或缺失会影响细胞和组织的生理功能。然而，利用这些甲醛固定石蜡包埋（FFPE）样本进行回顾性研究，常受限于从中提取的核酸已经降解的状态。一种与 FFPE 组织兼容的 DNA 甲基化分析方法，可为利用这一丰富的回顾性样本资源开展研究开辟途径。

Sanger测序作为检测 5-meC 的金标准已有 25 年以上历史，能够在长度最多 400 个核苷酸的短基因组 DNA（gDNA）区域内检测多个位点的 5-meC。检测 DNA 中 5-meC 最广泛使用的方法是对 gDNA 进行亚硫酸盐处理。Methyl-Seq Direct 工作流程是一种新的亚硫酸盐测序方法，采用 Applied Biosystems BigDye Direct (BDD)循环测序试剂盒进行测序，并使用 BigDye XTerminator 进行测序产物纯化。整个流程包括亚硫酸盐转化、PCR 扩增和 DNA 测序，耗时约 7 小时，其中约 1 小时为上机操作时间。该流程兼容 FFPE 样本，可利用存档样本开展肿瘤学或其他病理的回顾性研究。

应用说明：Methyl-Seq Direct 工作流程 — 一种快速的 DNA 甲基化分析方法

为证明该协议在从 FFPE 组织提取的 DNA 上的可行性，处理了两对匹配的正常组织和肿瘤组织样本。图 1 显示正常组织与肿瘤组织之间在甲基化模式上存在明显的离散差异。

在本应用说明中，我们演示了利用赛默飞提供的试剂、仪器和软件，对来自细胞系和 FFPE 样本的亚硫酸盐转化 DNA 进行甲基化分析的直接 PCR 测序工作流程的可行性。SeqStudio 基因分析仪是一台既能进行Sanger测序又能做片段分析的经济型仪器，可为后续甲基化研究快速提供结果。这使得将此类样本用于回顾性研究成为可能。

研究人类疾病发生与发展的工作在很大程度上依赖于对体外培养的离体人源细胞系的分析。然而，越来越被重视的问题是，体外培养的细胞可能被错误鉴定或被其他无关细胞系污染。细胞系的身份可通过分析高度可变的短串联重复序列（STR）所形成的高度特异性的遗传“指纹”来验证。SeqStudio 平台可与 Thermo Fisher Scientific 的细胞系鉴定解决方案良好集成。Applied Biosystems Identifiler Plus 和 Identifiler Direct 试剂盒分别可用于纯化后和粗提的 DNA，用于分析常用于验证细胞系真实性的 16 个高度可变的人源 STR 位点。Applied Biosystems GeneMapper 软件用于分析 Identifiler 试剂盒鉴定的等位基因，且兼容 SeqStudio 仪器生成的数据；分析结果可用于查询 ATCC 或其他 STR 数据库以核实细胞系身份。

 案例研究：使用 CLA Identifiler STR 分型试剂盒匹配 iPSC 与供体身份
 应用说明：使用 Identifiler 试剂盒和毛细管电泳平台对人源细胞系进行鉴定
网络研讨会：人源细胞系鉴定的完整工作流程

为展示 SeqStudio 仪器在细胞系鉴定工作流程中的实用性，从五种不同且常用的人源细胞系中获得了 STR 的等位基因信息。在仅有 300 pg gDNA 的情况下，仍能确认细胞系身份。为展示检测污染细胞的能力，将一定比例的 HeLa 细胞加入 M4A4GFP 细胞群体，并使用 Identifiler Direct 试剂盒进行分析。即使 HeLa 细胞仅占群体的 10%，仍可检测到 HeLa 特异性等位基因（见图 1）。因此，结合 Identifiler 试剂盒，SeqStudio 仪器可作为细胞系鉴定解决方案的核心组成部分。

Figure 1. 在 SeqStudio 仪器上进行的细胞系污染分析。将 HeLa 细胞与 M4A4GFP 细胞悬液稀释至 5 × 10^5 细胞/mL，按标示比例混合，并点样到 NUCLEIC‑CARD 样品采集装置上 。当污染的 HeLa 细胞约占群体的 20% 时，可在 SeqStudio 仪器上高置信度检测到；但若仅占约 10%，某些 HeLa 特有等位基因仍可被检测到。

临床研究人员可使用 SeqStudio基因分析仪 来保持检测和验证肿瘤组织中突变等位基因存在的金标准质量。SeqStudio 系统与下列工具集成，以简化Sanger测序工作流程：

• SeqStudio 基因分析仪预装了针对从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中提取的片段化 DNA 优化的运行模块。
• NGC 模块基于云的平台（Thermo Fisher Cloud）允许研究人员使用Sanger测序峰图，快速验证在下一代测序 (NGS) .vcf 文件中识别出的变体。
• 使用 Applied Biosystems Minor Variant Finder (MVF) 软件，并结合由 SeqStudio 仪器产生的Sanger测序峰图，可检测低至 5% 的等位基因变异频率。
• Applied Biosystems BigDye Direct 和 BigDye XTerminator 试剂体系通过提供一管完成的测序与纯化，简化了Sanger测序工作流程。

 应用说明：使用Sanger测序在 FFPE 样品中检测低丰度体细胞突变

为评估 SeqStudio 基因分析仪在肿瘤样品中检测突变等位基因的性能，我们分析了来自 10 例不同 FFPE 肿瘤样品的基因组 DNA，并测定了 4 个不同热点位点的变体频率。突变等位基因频率通过两种方法确定：一是使用基于NGS平台的 Ion Torrent Oncomine Oncology Focus Panel，二是使用 BigDye Direct/BigDye XTerminator 试剂体系进行Sanger测序并用 MVF 软件分析。与 NGS 测得的等位基因频率相比，SeqStudio 基因分析仪测得的频率在约 9% 至约 70% 的范围内显示出高度相关（图 1）。

还使用含有针对 KRAS 和 NRAS 中最常见致瘤突变的Sanger测序引物的 96 孔板，评估了 SeqStudio 基因分析仪分析变体频率的能力。对 SeqStudio 仪器峰图进行的小等位基因频率分析能准确测定从 FFPE 提取并稀释到 1 ng 的 DNA 的等位基因频率（图 2A）。因此，需要检测稀有等位基因的研究人员可以有信心，SeqStudio 基因分析仪在 FFPE 组织样品上能产生准确结果。

最后，基于云的 NGC 应用通过按扩增子和样本组织Sanger测序峰图，并将其按正确方向与 .vcf 文件中的候选变体序列比对，从而简化了对 NGS 识别变体的确认。为展示 NGC 应用在肿瘤学工作流程中的实用性，我们对使用 Oncomine Oncology Focus panel 识别出的 NRAS 突变通过Sanger测序进行了验证（图 2B）。SeqStudio 的结果证实了 NRAS 中的突变（p.Ala59Thr）的存在。因此，NGC 应用对测序峰图中最有意义区域的集中且快速检查，有助于加速 NGS 变体的确认。

基因组数据的广泛可获得性使得通过对“指纹”位点的DNA测序来鉴定未知样本中的物种成为可能。例如，Applied Biosystems 系列试剂盒（如 MicroSEQ 试剂盒）通过对核糖体 DNA (rDNA) 序列进行Sanger测序，简化了原核生物和真菌的鉴定。该策略已在 Barcode of Life 项目（barcodeoflife.org）中得到应用，为快速确定未知真核样本的身份提供了手段。

为说明 SeqStudio 基因分析仪在微生物鉴定方面的性能，我们从 ATCC 获取了多种微生物的基因组 DNA 样品，并使用 Applied Biosystems MicroSEQ 500 PCR 试剂盒和 SeqStudio 仪器对其进行测序。得到的序列在 BLAST 数据库中进行比对查询。对于每次测序反应，均以最高的 BLAST 置信度识别出正确的物种。同样，使用针对鱼类线粒体序列（CO1 基因）的引物和鱼类样品时，鱼种作为 BLAST 的首要匹配被正确识别。采用 BLAST 对查询物种的准确鉴定表明，SeqStudio 平台可可靠用于物种鉴定。

表1. 使用 SeqStudio 基因分析仪进行物种鉴定分析。使用针对16S rDNA 的引物并采用 MicroSEQ 试剂盒（BigDye Terminator v1.1 化学体系）对微生物 DNA 样品或从鱼类提取的基因组 DNA 进行测序；或使用针对鱼类线粒体 CO1 序列的引物并采用 BigDye Terminator v3.1 化学体系进行测序。

应用说明：16S Direct 工作流程——在 SeqStudio 基因分析仪上使用16S基因测序进行微生物鉴定，并用 MicrobeBridge 软件进行分析

应用说明：16S Direct 工作流程——在 SeqStudio 基因分析仪上使用16S基因测序进行微生物鉴定，并用 SmartGene 网络应用进行分析

基因组不稳定性是许多癌症类型的特征，通常由 DNA 错配修复（MMR）酶的失调引起。由于至少有11个不同的位点参与 MMR，逐一查找所有位点中的失活事件既复杂、耗时，又昂贵。此外，MMR 分析通常通过免疫组织化学（IHC）进行，其结果充其量是半定量的，并且依赖主观判断，不同操作者之间可能存在差异。因此，是否更有利于直接检测由 MMR 失调产生的功能性结果——微卫星不稳定性（MSI）？这可以通过基于PCR和片段分析的分子MSI检测来实现。

我们开发了TrueMark MSI Assay，该检测包含扩展的13个微卫星标记面板以及2个高度可变的短串联重复（STR）序列，可用于追踪样本身份。在5个荧光通道上对13个位点的分析，增加了可用于判定MSI状态的序列多样性。该检测已针对SeqStudio和3500系列基因分析仪进行了优化。此外，我们开发了TrueMark MSI Analysis Software用于分析该检测。该软件无需并列分析配对的正常非肿瘤组织，并提供自动判定功能。

应用说明：用于分析FFPE肿瘤样本微卫星不稳定性的简化方案。

为评估TrueMark MSI Assay在多种肿瘤类型中的性能，我们从商业来源获得了317例用于研究的FFPE肿瘤样本，包括结直肠（CRC）、胃、子宫内膜及其他类型。从这些样本中提取了基因组DNA（gDNA），并按在结直肠、胃和子宫内膜肿瘤中检测到的MSI-H样本数量与已发表的结果相近。TrueMark MSI Assay随附的方案在SeqStudio和3500xl上进行分析。TrueMark MSI Assay能够将肿瘤按MSI水平分类为稳定（MSS）、低水平不稳定（MSI-L）或高水平不稳定（MSI-H）（见表1）。此外，TrueMark MSI Assay在其他肿瘤类型（包括乳腺、腹部和肺部肿瘤）中检测到MSI的能力，表明该检测在常见MSI事件之外亦具有应用价值。

表1. 不同肿瘤类型中的MSI分析。从所示肿瘤样本及其相邻正常组织的FFPE载玻片切片中提取了DNA，并使用TrueMark MSI Assay和TrueMark MSI Analysis Software进行了分析。TrueMark MSI Analysis Software的判定标准为：若无位点表现出不稳定则判为MSS；若有1–4个位点表现出不稳定则判为MSI-L；若有超过4个位点表现出不稳定则判为MSI-H。

研究由位点拷贝数变化引起的遗传性人类疾病的常用方法之一是多重连接依赖探针扩增（MLPA）。该方法由MRC Holland开发并商业化，可分析最多50对成对相邻并与目标位点杂交的探针。分析MLPA探针扩增产物所需的高动态范围、尺寸精度和峰高保真度，使得SeqStudio系统成为进行MLPA分析的理想平台。在SeqStudio仪器上获得的结果可与MRC Holland的Coffalyzer.Net软件兼容，用于分析MLPA数据。

在 SeqStudio 仪器上使用 MLPA，利用 MRC Holland 的 P034 DMD 检测试剂组对一份已知携带 Duchenne 肌营养不良症（DMD）基因第2–30外显子重复的样本以及一份正常样本进行分析。这些样品的峰高和相对峰面积可以直接转换为对含重复区域的准确检测（图1）。使用针对大缺失和小缺失的探针也获得了类似结果。因此，SeqStudio 仪器可作为用于分析含有 CNV（拷贝数变异）区域的 MLPA 检测的一体化工具。

 应用说明：在 SeqStudio 基因分析仪上进行 MLPA 检测

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Sanger测序最常见的应用之一是分析亚克隆到质粒中的插入片段。Applied Biosystems BigDye 化学试剂广泛用于Sanger测序，是质粒测序工作流程的组成部分。SeqStudio 平台的一些新功能可为执行基础质粒测序方法的研究人员带来优势。该仪器预置有针对短读长（<300 bp）、中等读长（500 bp）和长读长（>600 bp）优化的测序模块，且可在仪器上进行自定义以满足特定需求。可更换的盒匣可关联到单独的项目和用户。基于云的 Sanger Quality Check 应用提供了一套直观的工具以分析测序峰图。此外，云连接功能可实现对测序信息的远程监控、访问和共享，帮助协作人员快速分析相同的数据集。

通过使用 M13 引物和 Applied Biosystems 的 BigDye Terminator v3.1 试剂对 pGEM7zf+ 质粒进行测序，来评估 SeqStudio 仪器在质粒测序方面的性能。通过在 Thermo Fisher Cloud 上使用 Sanger Quality Check 模块分析测序峰图，获得了结果 Thermo Fisher Cloud（图1）。如图示例所示，相同质粒在16个孔中进行了测序，并在 SeqStudio基因分析仪 上以4次不同进样进行分析。注意，峰图得分、峰下峰（PUP）值、连贯读长（CRL）和 QV20+（质量值 > 20 的长度）在每个样本间相似。在对另一条链的峰图以及使用 Applied Biosystems 的 BigDye Terminator v1.1 试剂进行的其他实验中也获得了类似结果。这些数据表明 SeqStudio 平台能够生成高质量的质粒测序结果。

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图1. 使用 Sanger Quality Check Cloud 应用分析测序质量。 (A) 一旦运行完成，SeqStudio 仪器会显示获得的序列文件及每个碱基的质量评分。(B) 在 SeqStudio 仪器上分别运行了16个独立的 pGEM7zf+ 测序反应，并将生成的 .ab1 文件上传至云端进行分析。请注意，这16个不同反应的测序指标非常相似。CRL = 连续读取长度；QV20+ = 质量值大于20的碱基数。

重复DNA扩增是指由任意数量的多个核苷酸重复构成的DNA突变的统称。这些区域常因GC含量高而难以扩增，从而也难以表征。短串联重复序列（STR）是重复DNA的一类。它们由1至6个核苷酸的重复单元在基因组长片段上反复出现组成，对于理解30多种使人致残的遗传疾病至关重要。

利用毛细管电泳（CE）进行片段定尺，特别适合检测与疾病相关的重复DNA区段。这些区域常因GC含量高而尤其难以扩增和分析。因此，对 SeqStudio 基因分析仪进行了评估，以为与 Asuragen AmplideX™ PCR/CE FMR1 和 C9orf72 试剂配合使用建立并验证推荐的注样与运行参数，从而成功分析这些具有挑战性的区域。当发生扩展时，FMR1 基因会导致脆性X综合征。同样，C9orf72 扩展可导致额颞痴呆、肌萎缩侧索硬化（ALS）或两者兼有。

白皮书：SeqStudio 基因分析仪结合 AmplideX PCR/CE 试剂简化三核苷酸重复扩展的分析

AmplideX PCR/CE 试剂结合重复引物PCR和毛细管电泳，可同时报告覆盖STR区域的全长扩增子以及提供致病等位基因确认性峰型的重复引物产物。该方法已在 Applied Biosystems 3130、3500 和 3730 毛细管电泳平台上得到充分建立，并自2010年以来在75篇以上的文献中有所报道。然而，SeqStudio CE 仪器采用更短的阵列和 POP-1 凝胶聚合物，因此需要优化运行参数，才能达到 AmplideX PCR 试剂在先前仪器上的性能表现。为此，开展了一系列实验，以确定并验证 SeqStudio 仪器的特定运行参数，使其符合 AmplideX PCR/CE 试剂的性能要求。优先实验旨在确定针对长片段检测（如 Asuragen 的 FMR1 和 C9orf72）所需的运行参数，这些检测要求片段定尺分辨率超过800碱基对。易用的 SeqStudio 系统与对重复序列扩增友好的 AmplideX PCR 试剂相结合，可对难以测定的 GC 富集和 AT 富集重复扩展进行基因分型。

SeqStudio 系统上的 FragAnalysis 或 LongFragAnalysis 模块对信号强度的影响相当。然而，尽管使用 FragAnalysis 模块可获得更高的信号强度（约提高50%），但对信号饱和的基因特异性峰，观察到峰分裂的形态。由于 FMR1 与 C9orf72 均出现该类峰型，因而以 LongFragAnalysis 作为基础模块，采用2秒注样、注样和运行电压均为6 kV，以及运行时间3,300秒（55分钟）。这些条件得到的峰型与3500xL仪器相似，并用于随后的精密度与灵敏度分析（图1）。

多重qPCR方案适用于检测少量病原体，但其相对较小的通量在需要检测大量目标或病原体时可能成为限制因素。通过毛细管电泳（CE）进行的片段分析，可在单一样本中用于检测与不同综合征相关的多种病原体。

我们描述了一个简单的流程，可使用片段分析对来自病原病毒的多个扩增子进行分析（见 Figure 1）。为说明该方法，我们分析了来源于 SARS-CoV-2 的目标序列，并展示了如何使用阳性对照合成 DNA 序列来定义并区分目标扩增子片段的大小。我们使用已知数量的 SARS-CoV-2 RNA 基因组来演示该方法的灵敏度。

应用说明：用于检测病毒病原体（包括 SARS-CoV-2）的多重目标片段分析
方案：使用片段分析检测 SARS-CoV-2 的 RNA
了解更多关于Sanger测序和片段分析在 SARS-CoV-2 研究中的解决方案

简要说明：对于该应用，在确定合适的目标序列后，应将扩增子设计为150–500个核苷酸长度。每个扩增子的长度应唯一，且与其他扩增子的长度差至少为5个核苷酸。正向引物应在5´端用荧光染料标记，反向引物应不标记。随后设置逆转录聚合酶链反应（RT-PCR），使用能够在同一反应管中先合成cDNA、随后进行终点PCR的体系（例如 TaqMan Fast Virus 1-Step 预混液）。将核酸样品进行 PCR，所得片段随后通过 CE 进行分离。是否出现与预期大小一致的病原体特异性片段，将用于判断样品中该病原体的有无（见 Table 1）。峰高可作为样品中目标丰度的半定量指标。

检测单核苷酸多态性（SNP）的能力对于理解基因组如何影响生物表型具有关键作用。为分析SNP变体，开发了Applied Biosystems SNaPshot 多重检测系统。可定制的不同大小并带色标的片段对应特定等位基因，通过片段分析进行检测。SeqStudio 系统新增了便于 SNaPshot 分析的功能，包括内置的片段分析报告，可报告片段大小和峰面积。此外，在同一板上混合片段分析和测序反应的能力使研究人员能够在一次运行中同时进行SNP分型和Sanger测序。

为展示 SeqStudio 仪器在 SNaPshot 工作流程中的实用性，收集了来自 FFPE 固定肿瘤切片的基因组 DNA，并使用 SNaPshot 多重试剂盒中的探针对 KRAS G12X 和 G13X 等位基因进行了分析。SeqStudio 仪器获得的结果清楚显示了该位点不同等位基因的存在，并给出准确的判定（图1）。注意：尽管 SeqStudio 仪器对等位基因的检测是准确的，但与其他平台相比，所有峰的绝对迁移位置会略有差异，这是由不同聚合物的化学性质差异导致的。因此，为了在无歧义的情况下将峰对应到特定等位基因，应在开展大规模分析之前使用已知等位基因进行校准。

Applied Biosystems SeqStudio 法医版基因分析仪 可一键提供行业标准的 STR 片段分析和Sanger测序。该系统可兼容各种法医 STR 检测试剂盒和应用，并便于多位用户使用。凭借 Applied Biosystems 仪器，您将获得一贯值得信赖的数据质量、服务和支持。

 法医遗传学——在学术环境中使用 SeqStudio 基因分析仪进行人类身份鉴定
 毛细管电泳（CE）和下一代测序（NGS）在法医 DNA 分析中的应用