荧光Western Blotting

荧光Western Blot因能够进行多重检测（即同时检测多种蛋白）而越来越受欢迎。过去，用于荧光检测的仪器无法满足许多研究人员对灵敏度的需求，或者价格过于昂贵。 随着先进数字成像仪器 Invitrogen iBright FL1500 Imaging System的推出,以及荧光偶联技术的进步，科学家们现在拥有了利用多种荧光染料和抗体进行Western Blot检测的必要工具。这些进步使得荧光检测的成本降低，灵敏度提升。

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在荧光免疫印迹检测系统中，信号以光的形式被捕获。荧光分子（荧光基团）在被激发后会发射瞬时光，随后随着激发分子回到正常状态释放光子。相比之下，显色和化学发光免疫检测系统产生的信号是酶-底物反应的产物。显色酶-底物反应会产生沉积在膜上的有色产物，而化学发光检测系统则通过酶促反应产生以光能形式释放的能量。总体而言，化学发光和荧光检测方法的免疫印迹实验流程类似，每种方法都具有其特定的优势。

与酶促反应类似，荧光试剂也必须针对信噪比进行优化。如果荧光标记程度过低，信号会很弱。然而，如果荧光标记程度过高，信号也可能会变弱，这是由于检测试剂失活或由称为FRET（福斯特共振能量转移）现象引起的信号猝灭所致。

荧光与化学发光的蛋白印迹检测

虽然荧光检测的检测限不如化学发光检测低，但荧光检测具有独特优势，可以在同一膜上同时检测多个靶标，无需剥离和重新孵育。多重检测有助于提高研究的效率和产出。例如，可以同时观察感兴趣的蛋白与内参蛋白，或区分分子量相近的蛋白，或评估复杂的生物通路。 使用 iBright FL1500 Imaging System,配合合适的实验设置，可以进行最多四重荧光蛋白印迹检测。

除了实现多重检测外，荧光蛋白印迹检测相比于酶促化学发光底物检测还有其他优势。荧光蛋白印迹能够提供准确、定量的结果，信号稳定，并且由于多重检测能够节省样品。

荧光检测的优势

• 定量蛋白印迹技术具有更广的可量化线性范围
• 检测多个靶标时无需剥离和重新孵育膜
• 信号稳定
• 多重检测能够节省样品

可检测分子量相近的靶标. 荧光多重检测能够在同一膜上清晰区分多个靶标，即使它们分子量相近。下图展示了合成图像以及显示各个蛋白单色信号的图像。观察单独信号有时可以评估在合成图像中不易察觉的细节。

在开始荧光蛋白免疫印迹实验时，需要优化一些试剂和步骤，以确保背景荧光不会干扰目标蛋白的检测。以下是一些入门建议：

• 含有溴酚蓝的样品缓冲液会产生荧光，可能导致背景增加。虽然可以在转膜前将染料前沿跑出凝胶，或在转膜后从膜上剪除，以避免背景荧光信号，但理想情况下应使用不含溴酚蓝的荧光兼容样品缓冲液, 例如 荧光兼容样品缓冲液.

• 减少加到凝胶上的分子量标记物的用量.可以使用标准预染分子量标记物，但如果标记物含有荧光条带，则需要优化加样量，因为加样过多会增加背景荧光并导致信号串扰到相邻泳道。The iBright 预染蛋白 Ladder (Cat. No. LC5615) 提供预染蛋白以及用于检测的荧光条带。通常，2–4 µL的iBright预染蛋白标准足以进行可视化和荧光检测。
• 为消除主要的背景荧光来源，应使用低自发荧光的转膜，如硝酸纤维素膜和专用低荧光PVDF膜 例如硝酸纤维素膜 (Cat. No. 88018) and 低荧光PVDF转膜 (Cat. No. 22860).

• 仅使用高质量过滤缓冲液 如 Blocker FL Fluorescent Blocking Buffer (Cat. No. 37565).洗涤和阻断缓冲液中的颗粒和污染物可能沉积在膜上，产生荧光伪影。此外，在阻断步骤中应限制洗涤剂的使用，因为常见洗涤剂会自发荧光并增加非特异性背景。
• 仅用戴手套的手和干净的钝镊子操作膜，以减少污染和划痕，这些都可能导致背景荧光和伪影。避免在膜上使用笔，因为许多墨水会发荧光。
• 在荧光应用中，二抗浓度通常较高。需要优化以获得最佳信噪比，但无论荧光标记类型如何，推荐浓度范围通常为0.4至0.1 µg/mL（1:5,000–1:20,000），适用于CCD成像系统。Alexa Fluor Plus二抗专为提供高信噪比和较低的交叉反应性而设计，可减少优化所需时间。

Explore:适用于荧光的试剂

多重蛋白免疫印迹抗体的选择

在设计荧光多重蛋白免疫印迹实验时，选择合适的一抗和荧光标记的二抗至关重要。以下是一些需要考虑的指导原则：

• 选择专门用于蛋白质印迹（western blot）或将蛋白质印迹列为应用之一的抗体。在与其他靶标进行多重检测之前，先分别验证每个蛋白靶标的检测效果。这样可以在进行多重实验前确定每种抗体的条带模式。
• 针对每个检测靶标，使用来自不同宿主物种的一级抗体。理想情况下，选择两个进化关系较远的物种（如大鼠和兔），避免使用如小鼠与大鼠或山羊与绵羊这样的组合。这有助于选择合适的二级抗体，从而最大程度减少抗体间的交叉反应，避免产生混淆的结果。
• 如果你的蛋白带有表位标签（如6xHis、HA），你可以利用专门针对该表位标签的荧光染料标记的一级抗体。直接与荧光染料结合的一抗无需使用荧光染料标记的二抗。这可以减少多重实验中所需的二抗数量，但仍需仔细考虑一抗的宿主物种，以防止实验中使用的其他一抗与二抗发生交叉反应。如果市面上没有特定的直接标记抗体，也可以使用荧光标记试剂盒进行标记。如果难以区分一抗的宿主物种，可以考虑选择属于单一特定抗体类别（如IgM、IgG等）或亚型（如IgG1、IgG2a等）的抗体，并选择只识别该特定宿主类别或亚型的相关二抗。如果您不确定抗体的特异性，请联系您的抗体供应商以获取更多信息。
• 此外，可以考虑使用高度交叉吸附的二抗。交叉吸附是一种纯化过程，有助于去除抗体混合物中的非特异性抗体，例如特定类别、亚型或宿主物种的抗体。如果您不确定二抗的潜在交叉反应性，请联系您的抗体供应商以获取更多信息。

Explore:抗体

在多重蛋白免疫印迹实验中，理想情况下每个目标蛋白都应在消除荧光探针串扰的条件下，于不同的图像中独立捕获。因此，在开始实验前，了解免疫印迹成像仪的配置至关重要，尤其是可用的激发和发射滤光片组。许多成像系统使用激发和发射滤光片组的组合，可以选择让特定波长范围的光通过，以激发荧光团，并让特定荧光团发射的光进入摄像头探测器。有些仪器可能不使用滤光片组，而是采用独立的窄谱光源进行激发。所用的激发和发射条件的具体组合通常被称为“通道”或“层”，决定了哪些荧光探针可以被单独成像。根据仪器的不同，可用的滤光片可能是预装的，也可能需要安装。

使用诸如 荧光光谱查看器 在特定成像仪器所配备的激发和发射滤光片的背景下，确定可用荧光染料之间的激发和发射光谱重叠情况。理想情况下，多重实验中使用的荧光染料应具有与成像系统滤光片兼容的激发或发射光谱的独特区域。请注意，只需要激发或发射光谱中的某一部分区域是独特的（不需要两者都独特）。

可用于iBright FL1500成像系统的多重荧光染料组合示例

与 Invitrogen Alexa Fluor Plus dyes 染料偶联的二抗专为多种多重荧光蛋白免疫分析方法设计，包括多重蛋白印迹检测。与主流Alexa Fluor二抗相比，Alexa Fluor Plus二抗在免疫荧光成像中信噪比最高可提升4.2倍，在蛋白印迹荧光检测中信噪比最高可提升5.8倍，同时具有更低的交叉反应性。

由于荧光的信号输出与样品中蛋白质的含量成正比，因此可以通过实验进行定量测量。当研究某些处理对蛋白表达水平产生变化时，这一特点非常有用。然而，为了验证任何变化确实是由处理引起的，而不是由于加载样品量的变化，蛋白靶标信号必须进行归一化处理。

传统上，归一化通常使用管家蛋白进行，这类蛋白通常以恒定水平表达，用于归一化结果。GAPDH、β-肌动蛋白和β-微管蛋白是常用的管家蛋白，常被称为上样对照蛋白。选择哪种上样对照蛋白用于检测，取决于实验处理是否可能影响管家蛋白的表达。在检测管家蛋白时，所用的结合物或颜色应与目标蛋白检测不同。荧光强度被测量后，通常以目标蛋白强度与归一化蛋白强度的比值表示。在进行这些多重实验时，选择不会交叉反应的二抗非常重要。预先结合的上样对照抗体可以简化这些定量实验，无需为这些高丰度靶标使用二抗。

管家蛋白常常会受到实验条件的影响，并且由于其高丰度，信号容易过饱和 I在这种情况下，总蛋白归一化是定量更好的策略。总蛋白分析不受上样对照蛋白局限的影响，利用加载的总蛋白量对目标信号进行归一化。总蛋白加载量可以通过多种 protein membrane stains or 标记试剂, 如 No-Stain Protein Labeling reagent 来确定. 在归一化时，重要的是要对膜上的总蛋白加载量进行归一化，以补偿转膜效率的变化。

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在检测任何蛋白免疫印迹（western blot）时，建议使用预染分子量标记物（也称为蛋白梯度），这些标记物会与蛋白样品一起转移到膜上。分子量标记物在膜上的出现可以估算任何检测到的蛋白条带的分子量，并验证在转膜步骤之前目标蛋白在凝胶中的有效分离。用于制作预染分子量标记物的染料通常具有一定的荧光特性，但它们的信号可能会掩盖目标蛋白的荧光。使用专为荧光免疫印迹设计的蛋白梯度可以帮助平衡荧光信号。此外，标记有荧光染料的蛋白分子量标记物可以提供更好的信噪比。

1. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. (1992) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Biotechnology 24:145–149.
2. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. (2008) Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 10:10.
3. Eaton, S. L., et al. (2013) Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent western blotting. PLoS One 8:72457.

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