Western Blot 实验方案和试剂配方

Q1. 做 Western blot 时条带总是很弱、背景又很高，应该如何从样本制备到封闭、抗体、ECL 系统化排查？

1. 样本制备与上样量
   • 确认裂解条件是否足够（裂解缓冲液成分、裂解时间、超声/震荡强度等），加入蛋白酶/磷酸酶抑制剂，避免靶蛋白降解或去磷酸化。
   • 使用 BCA、Bradford 等方法准确定量蛋白，保证每个泳道上样量一致，必要时适当增加上样量。
2. 电泳与转膜
   • 条带弱要首先排除“没有转上膜”：可用 Ponceau S 快速染色检查转膜效率。
   • 根据蛋白分子量选择合适的凝胶体系和转膜时间/电流；使用匹配的转印缓冲液和膜（例如 Thermo Scientific PVDF 或硝酸纤维素膜，配合 NuPAGE 或 Tris-Glycine 转印缓冲液）。
   • 重复性要求高时，可考虑使用 Invitrogen Mini Blot 湿转模块、Power Blotter 半干转系统或 iBlot 3 干式转印系统，减少手动操作误差。
3. 封闭和洗膜
   • 背景高常见于封闭不足或封闭剂不适配。可尝试更换封闭剂（如澄清奶粉、BSA 或 Blocker 系列封闭液），延长封闭时间，确保摇晃充分。
   • 洗膜不充分会明显抬高背景，可适当增加洗膜次数、时间或 Tween-20 浓度，同时避免过度洗涤导致信号下降。
4. 抗体选择和稀释
   • 选择经过 WB 验证的一抗和高度交叉吸附的二抗，按供应商推荐起始稀释度进行优化。例如在 Thermo Scientific 化学发光底物的实验方案中，会给出针对不同底物的一抗、二抗推荐稀释范围。
   • 条带弱时，可适当提高一抗浓度或延长孵育时间；背景高时则降低抗体浓度或缩短孵育时间。
5. ECL 底物与成像
   • 根据靶蛋白丰度选择合适灵敏度的 HRP 化学发光底物（如 SuperSignal West Pico PLUS、Dura、Femto、Atto 等），避免用过高灵敏度底物却配合高抗体浓度，导致整体背景抬升或信号饱和。
   • 使用稳定、线性范围宽的成像系统（如 Invitrogen iBright 智能成像系统），优化曝光时间和增益，避免过曝或信号太弱。

Q2. WB 转膜效率总是不稳定，湿转、半干转和干式快速转膜分别有什么优缺点？适合哪些胶和目标蛋白？

湿转（Mini Blot 湿转模块等）

• 优点：缓冲液体积大，散热好，适合高分子量或疏水性较强的蛋白，转膜均一性好。
• 缺点：时间较长（1–2 小时甚至过夜），耗缓冲液多，搭层稍复杂。
• 适用场景：
  • 高分子量蛋白（>120 kDa）或复合物；
  • 对条带形态和定量要求较高的常规 WB。

半干转（Power Blotter 快速蛋白转印系统）

• 优点：转膜时间短（通常 5–10 分钟），缓冲液消耗少，适合常规实验室高通量操作。
• 缺点：对转印夹层厚度、预湿程度敏感，大蛋白可能转不完全。
• 适用场景：
  • 中等分子量蛋白（约 20–120 kDa）；
  • 需要在短时间内完成多块胶的例行 WB。

干式转膜（iBlot 3 干式转印系统）

• 优点：预装转印膜组件，操作步骤少、速度非常快（约 7 分钟完成转膜），重复性好，适合作为标准化平台。
• 缺点：需要专用转印耗材，初期设备投入相对较高。
• 适用场景：
  • 对实验节奏、重现性要求高的核心平台或药筛项目；
  • 使用标准化预制胶（如 Bolt Bis-Tris Plus 胶）和匹配转印缓冲液的体系。

不论哪种方式，都建议结合适配的转印缓冲液和膜（PVDF 或硝酸纤维素），并通过 Ponceau S 染色或预染 Marker 检查每次转膜质量。

Q3. 做多色荧光 Western blot（例如同时检测总蛋白和磷酸化蛋白）时，应该如何设计一抗和二抗的荧光组合？成像系统和滤光片有什么要求？

1. 抗体组合设计
   • 尽量选择来源物种不同的一抗（如兔抗磷酸化蛋白 + 小鼠抗总蛋白），避免二抗交叉反应。
   • 配套使用针对不同物种、标记不同荧光染料且高度交叉吸附的二抗，例如 Alexa Fluor Plus 系列二抗。
   • 为便于分辨和定量，建议选择光谱间隔较大的荧光组合，如 488/555/647 等。
2. 缓冲体系与耗材
   • 使用低自发荧光的 PVDF 膜（低荧光吸附膜）与专用荧光封闭液（如 Blocker FL），尽量减少背景。
   • 全程避免使用含有高浓度小分子胺或强自发荧光成分的封闭剂。
3. 成像系统和滤光片
   • 选择支持多通道荧光成像的设备，如 Invitrogen iBright 成像系统，确保各通道具有匹配的激发/发射滤光片。
   • 不同通道分别采集，避免串色；确认曝光时间处于线性范围内。
4. 实验设计小技巧
   • 在同一块膜上同时孵育多色二抗可以节省时间，但要先做单色对照验证是否有交叉信号。
   • 如需做条带归一化，可使用总蛋白染色（如总蛋白荧光染料）代替传统 “housekeeping” 内参。

Q4. 如果要给实验室新人做一场 WB 技术培训，从原理到常见问题，大纲应该包含哪些关键知识点？

建议的大纲可围绕 Thermo Fisher 网站中展示的 “6 大步骤” 展开，包括：凝胶电泳、转膜、孵育、检测、成像与分析、抗体剥离。

1. Western blot 原理概述
   • SDS-PAGE 分离蛋白的基本原理；
   • 蛋白向膜转移和与抗体特异性结合的过程；
   • 化学发光 vs 荧光检测的差异和适用场景。
2. Step 1：凝胶电泳
   • 凝胶类型选择（Tris-Glycine vs Bis-Tris 等）、浓度与分辨率；
   • 上样缓冲液、还原剂和变性条件；
   • 常见电泳问题（拖尾、笑脸胶、泳道弯曲）及解决。
3. Step 2：转膜
   • 转膜方式（湿转、半干转、干式转印）及设备对比；
   • PVDF 与硝酸纤维素膜的特点和选择；
   • 转膜效率检查与优化。
4. Step 3：封闭与抗体孵育
   • 不同封闭剂（奶粉、BSA、Blocker 系列）的特点；
   • 一抗、二抗的选择与稀释优化；
   • 自动化孵育方案（如 iBind Flex 系统）简介。
5. Step 4–5：检测、成像与数据分析
   • 化学发光底物灵敏度选择和线性范围概念；
   • 荧光 WB 的多色检测策略；
   • 使用 iBright 成像系统进行拍照、分析和导出结果的基本流程。
6. Step 6：抗体剥离与再利用印迹膜
   • 抗体剥离原理与试剂（如 Restore 抗体剥离液）；
   • 适用与不适用的情形（高亲和力抗体、多次剥离对蛋白条带的影响）。
7. 常见问题与系统化排查
   • 条带弱、背景高、双条带、拖尾等典型问题案例；
   • 结合赛默飞官网上的 FAQ/指南，给出标准化排错流程。

Q5. 如果 WB 结果要用于药物筛选或高通量验证，有没有更自动化、更高通量的方案？从上样、转膜到孵育和成像如何整体设计？

1. 样本制备与电泳阶段
   • 采用预制胶（如 Invitrogen 预制蛋白胶）和预制上样缓冲液、电泳缓冲液，可以减少配制误差并提高批间一致性。
   • 配合多道移液器或自动加样平台，将样本组织成标准板式格式，便于下游数据对接。
2. 快速、标准化转膜
   • 使用 Power Blotter 半干转系统或 iBlot 3 干式转印系统，可在数分钟内完成转膜，适合一批多块胶连续操作，减少人工搭夹的重复劳动。
3. 自动化抗体孵育
   • 采用 iBind Flex 蛋白质免疫印迹处理系统，实现封闭和抗体孵育的自动化，大幅减少手动换液和摇床占用时间，并提高不同实验者之间的一致性。
4. 高灵敏度检测与成像
   • 选用灵敏度和线性范围更宽的化学发光底物（如 SuperSignal West 系列），在保持高信噪比的同时获得更大可定量区间。
   • 使用 iBright 智能成像系统进行自动曝光和批量采集，可建立固定的曝光和分析模板，一键输出条带强度和归一化数据。
5. 流程整合与数据管理
   • 建议为“样本信息-胶编号-膜编号-成像文件名”建立统一命名和条码体系，配合 LIMS 或电子实验记录，方便药筛或高通量项目的长期追踪和比对。
   • 若项目规模进一步放大，可考虑在早期筛选阶段使用高通量 ELISA、HCS 等方法，WB 作为关键命中结果的验证手段，以平衡通量和信息量。