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FastDigest IIS 型限制性内切酶
IIS 型限制性内切酶包含一组特定的酶，可识别非对称 DNA 序列，并且在其识别序列之外的固定距离位置处切割，通常在 1-20 个核苷酸内。IIS 型限制性内切酶的这种特定作用模式被广泛应用于创新 DNA 操作技术，如 Golden Gate 克隆，可以对基因进行不依赖于序列的克隆，并且无需引入兼容的限制性酶切位点 (SCAR) 进行修饰。
使用FastDigest IIS 型限制性内切酶进行克隆的优势
- 单管克隆—由于限制性酶切位点已从连接产物中去除，因此可在同一管中同时进行酶切和连接反应。
- 无缝克隆—不会引入 scar 序列，因为生成的突出序列不是由限制性内切酶决定的
- 组装多个片段—通过使用互补末端的正确组合，可以同时组装多个插入片段。
赛默飞旗下 Thermo Scientific FastDigest IIS型限制性内切酶产品线中有多种 IIS 型限制性内切酶，其具有以下特性：
- 所有限制性内切酶和 DNA 修饰酶均使用一种通用缓冲液
- 所有类型的 DNA 均使用同一种酶切方案
- 15 分钟内即可完全酶切
- 即使过夜酶切也不会出现星号活性
- 酶切后可直接上样进行电泳，简化实验流程
FastDigest IIS 型限制性内切酶─订购信息
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限制性内切酶根据其切割模式（即切割是在识别位点内还是在识别位点外进行）的结构分为多种类型。
性能已经了解的比较清楚且常用的是经典 II 型限制性内切酶。这些酶可识别特定的 4 - 8 个核苷酸序列（通常为回文序列），并在识别位点内进行切割，生成粘性末端（5′ 或 3′ 突出端）或平末端。
相反，IIS 型限制性内切酶由一组特殊的酶组成，在识别序列下游的特定距离处切割 DNA。这主要是因为这些酶的结构，即催化和识别结构域由多肽连接子分开 [1]。
切割位点没有碱基识别的序列要求；因此，识别位点以外的序列可以是任何核苷酸组合。由于可能有 256 种突出末端序列，因此可以使用互补突出末端组装 DNA 的多个片段。这种克隆技术被广泛使用，也称为 Golden Gate 组装 [2]。
传统分子克隆实验流程涉及多个手动操作步骤。通常，质粒载体使用一种或多种限制性内切酶进行酶切，末端可进行去磷酸化，最后对线性化质粒进行凝胶纯化。与此同时，将需要克隆的片段进行酶切和凝胶纯化，或进行 PCR 扩增、酶切以产生兼容末端并进行柱纯化。然后使用 DNA 连接酶进行连接，并转化到大肠杆菌。传统的限制性内切酶克隆通常仅限于将单个 DNA 片段插入载体。
相比之下，Golden Gate 克隆利用 IIS 型限制性内切酶和 DNA 连接酶，在单个反应管中可将单个 DNA 片段或多个 DNA 片段插入到载体中。一般情况下，反应在热循环仪中进行，温度会在限制性内切酶最适温度 (37°C) 和 DNA 连接酶最适温度 (23°C) 的之间重复循环。因此， Golden Gate DNA 组装可以减少（或消除）多个手动操作步骤，并且无需琼脂糖凝胶纯化 [3]。
Golden Gate 克隆如何进行？
IIS 型限制性内切酶可在识别序列下游的非特异性位点切割 DNA，从而生成具有独特突出末端的 DNA 片段。然后，通过相邻片段上互补四碱基突出末端的退火，组装酶切片段。酶切后片段和最终组装体将不再含有 IIS 型限制性内切酶识别位点，因为酶结合的这些识别位点位于切割位点的上游，因此后续无法进一步进行酶切。连接产物中消除了限制性酶切识别位点，因此可以同时进行酶切和连接。最终的组装产物随时间而逐渐累积。
使用 IIS 型限制性内切酶克隆单个片段
所克隆的 DNA 片段可以是 PCR 产物、经克隆的 PCR 产物（例如来自 TOPO 和 CloneJET PCR 克隆试剂盒）、GeneArt String 或合成的 GeneArt 克隆。片段末端的 IIS 型限制性内切酶识别位点应符合以下条件：切割后片段留下两个粘性末端，但去除了酶结合位点（如橙色所示）。
载体必须采用类似的设计，但两个 IIS 型限制性内切酶识别位点应符合以下条件：切割后生成线性化载体以及与插入片段兼容的粘性末端，且去除了酶结合位点（图 1）。
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图 1.单个片段克隆。
使用 IIS 型限制性内切酶克隆多个片段
每个片段都有一组独特的突出末端，可决定组装的顺序。每个末端与下一个片段末端互补，它们在最终组装体中彼此相邻。T4 连接酶可按所需的顺序将互补突出末端连接起来，并组装到载体中（图 2）。
图 2.多片段克隆。
使用 IIS 型限制性内切酶克隆单个片段
所克隆的 DNA 片段可以是 PCR 产物、经克隆的 PCR 产物（例如来自 TOPO 和 CloneJET PCR 克隆试剂盒）、GeneArt String 或合成的 GeneArt 克隆。片段末端的 IIS 型限制性内切酶识别位点应符合以下条件：切割后片段留下两个粘性末端，但去除了酶结合位点（如橙色所示）。
载体必须采用类似的设计，但两个 IIS 型限制性内切酶识别位点应符合以下条件：切割后生成线性化载体以及与插入片段兼容的粘性末端，且去除了酶结合位点（图 1）。
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图 1.单个片段克隆。
使用 IIS 型限制性内切酶克隆多个片段
每个片段都有一组独特的突出末端，可决定组装的顺序。每个末端与下一个片段末端互补，它们在最终组装体中彼此相邻。T4 连接酶可按所需的顺序将互补突出末端连接起来，并组装到载体中（图 2）。
图 2.多片段克隆。
有多种方法可以设计使用 IIS 型限制性内切酶进行组装的序列。以下概述了两种最常用的方法（图 3）：
通过 PCR 生成片段（例如，长度 150 至 200 bp 的片段，或长达 3 kb 的 GeneArt Strings 片段）：
- 引物设计 – 引物应包含 IIS 型限制性内切酶识别位点和每个插入片段特有的 4 个核苷酸突出末端。
- PCR 扩增 – 使用含 IIS 型限制性内切酶识别位点的引物扩增感兴趣的序列。
- 酶切和连接 – 得到的带有互补突出末端的 PCR 片段，可按用户自定义的顺序组装和连接。
- 完成组装 – 片段可直接连接到最终目的载体。
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图 3.使用 PCR 生成适用于 IIS 型限制性内切酶的片段。
通过合成寡核苷酸生成克隆片段（适用于克隆短片段，例如具有 4 个核苷酸突出末端的 20 个核苷酸）（图 4）：
- 合成一对互补寡核苷酸，每个序列含一组独特的 4 核苷酸 5′ 突出末端，对应于最终组装体中所需的相邻片段。
- 将每个合成寡核苷酸的 5′ 末端进行磷酸化。
- 将合成寡核苷酸退火以形成双链体。
- 通过连接到最终目的载体完成片段组装。
图 4.使用合成寡核苷酸生成适用于 IIS 型限制性内切酶的片段。
参考文献
- Pingoud A, Jeltsch A (2001) Structure and function of type II restriction endonucleases.Nucleic Acids Res 29(18):3705-3727.
- Engler C, Kandzia R, Marillonnet S (2008) A One Pot, One Step, Precision Cloning Method with High Throughput Capability.PLoS ONE 3(11): e3647.
- Engler C, Gruetzner R, Kandzia R et al.(2009) Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.PLoS ONE 4(5):e5553.
相关资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。