HPLC-CAD 方法开发提示

 
 
 
产品简介

 
 
 
HPLC-CAD 方法开发需要考虑的因素

 
 
 
方法设置

一旦您 在实验室中正确设置了 HPLC-CAD 系统，您就可以开始方法开发。以下是您应该遵循的一些基本最佳实践，由我们的专家推荐：

1. 拥有一个专用的 HPLC-CAD 系统，可不与非挥发性添加剂 (如磷酸盐缓冲液或非挥发性离子配对试剂) 配合使用。
   
   
2. 只能使用具有最低“蒸发后残留物”规格的 LCMS 级溶剂和添加剂。
   
   
3. 仅使用挥发性流动相添加剂，因为非挥发性物质与 CAD 非常不兼容，并且可能对性能产生不利影响。
   
   
4. 从常规梯度开始，然后根据需要添加反向梯度进行优化。
   
   
5. 对于所有新方法，请使用 CAD 上相应的默认设置作为起点：
   
   
   • 蒸发温度35°C
     
     
   • 10 Hz的数据采集速率
     
     
   • 功率函数值为 1.0
     
     
   • 滤波时间常数为 5.0 s

 
 
 
方法侦察

除了筛选各种色谱柱和淋洗液混合物以选择实现成功分离的最佳组合外，您还需要评估您的化学品和方法条件是否与 CAD 兼容。

使用分步系统方法，您将了解每个组件如何影响基线信号或背景电流。

您的主要目标是了解在方法条件和应用中哪些背景信号是正常的。

以下是方法搜寻的一般步骤：

1.验证目标分析物是否符合   CAD 挥发性要求

如果您手头没有数字，则可以按我们的白皮书中所述测试分析物的挥发性：  一种可靠的 UHPLC/UV/CAD/MS 多检测器方法，用于药物级塑料中萃取物和溶出物的常规定量和库匹配。

2.  评估氮气的纯度和稳定性

该步骤涉及在没有柱和流动相流动的情况下通过 HPLC-CAD 系统运行氮气以查看气流和背景信号是否稳定。

3. 确认 HPLC 系统管路和泵没有残留盐。 *

在此步骤中，您将 只运行超纯实验室用水，不连接添加剂或柱，流速为 1 mL/min ，流速为 35 °C 时为 EvapT

• 您的背景信号不应高于 1 pA。

* 我们强烈建议您使用专用的 HPLC 系统，仅用于您的 CAD。如果不可能出现这种情况，则在连接 CAD 之前，您需要冲洗仪器以清除管路和泵中的残留盐，以及联机脱气机 (如果有)。

4. 在没有色谱柱的情况下，在 35 °C 时使用 EvapT 检查流动相的质量，无需添加剂

在此，您想跟踪 CAD 背景信号在流动相流动时的变化，以及您可以预期信号如何随流动相添加剂或不添加流动相而发生变化，以及固定相的影响。

• 没有添加剂的清洁溶剂 ，串联没有色谱柱应使您的最大信号达到 1 pA。

5.连接转向柱以确保固定相分解不会产生排气

在您所需的方法条件 (包括梯度和柱加热) 下，通过 HPLC-CAD 系统对任何添加剂进行流动相运行，以验证背景信号在低电流下保持稳定。

• 在整个工作 pH 值范围内 (例如硅基氨基和氰基色谱柱) 显示出显著的流失，而在靠近指定操作限值 (如 pH 值和温度) 时，某些色谱柱仅显示出显著的流失。
  
  
• 尽管   柱流失 可能会增加噪声和背景电流，但色谱柱性能通常可接受，并且色谱柱仍可能显示出非常稳定的保留时间和峰形。

6. 运行分析

同样，此处适用的规则与您的一般方法开发相同：稳定的基线，分辨峰值和足够的平衡时间。

• 检查分辨率和，根据确认或定量焦点区域，您可以继续进行方法优化—例如梯度微调，补充检测器 (在叠加峰情况下) 或互补梯度 (反向梯度)。

 
 
 
方法优化

优化您的 HPLC-CAD 方法涉及对多种方法条件进行迭代测试，以实现最佳分辨率，速度和重现性。

• 通过   更换 EvapT ，您可以将非挥发性物质转换为半挥发性物质。最佳做法是，如果您的模型允许，将 EvapT 增加 5 °C ，不要超过 CAD 上的最高温度设置。较高的温度可能会降低背景噪声，但也会降低半挥发物的信号。
  
  
• 应用   反向渐变。反梯度组成与分析梯度相反。在这些条件下，非挥发性分析物的 CAD 响应更均匀，可通过单个校准物获得更准确的定量测定。
  
  • 我们的反梯度向导使您可以通过最大化有机物含量来轻松生成互补梯度，从而提高响应能力。我们的   白皮书 重点介绍了反向梯度的三个选项。
     
• 其他可能的调整包括更改   功率功能 ，以帮助您优化 CAD 响应在给定方法定量范围内具有足够线性的范围。
  
  
• 在某些情况下，您可以    使用添加剂将半挥发性分析物转换为非挥发性分析物。请联系我们的技术支持团队以了解更多信息。

 
 
 
稳健性测试与验证

完成稳健性测试是为了确定分离方法变化参数的影响，这对   方法验证 和转移过程都非常重要。

• 在不同 EvapT 设置下评估校准曲线和标准品，以查看漂移和量程，并通过改变进样量。
  
  
• 对不同的原材料，色谱柱，散装和成品进行实验，以确定小的变化是否会导致数据发生巨大变化。
  
  
• 测试独立批次间的重复结果，以确定您方法的重现性。

 
 
 
HPLC-CAD方法开发资源

请参阅我们全面的 HPLC-CAD 方法开发和传输 资源。

 
 
 
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