背景

近红外(NIR)光谱已被广泛用于食品和农业领域，这始于USDA的卡尔·诺里斯（Karl Norris）在农产品质量方法方面的研究成果。但是，与基频振动产生的中红外光谱相比，近红外光谱是中红外光谱基频振动的倍频和合频吸收，表征了CH、NH和OH基团的拉伸和弯曲振动，光谱的吸收峰趋向于平滑而且范围比较广。因此，直到利用NIR光谱学的数学和计算机建模，才能通过NIR获得信息。随着化学计量学方法的实施，出现了用于区分和定量农产品和食品成分的有价值的工具。伴随着样品制备要求的减少（NIR的主要优势之一）以及NIR在便携手持式设备（如Thermo Scientific microPhazir NIR光谱仪）中的应用，可以让随后对食品、饲料和农产品样品进行的定性和定量检测走出实验室，直接在现场或仓库进行。

Thermo Scientific microPHAZIR RX分析仪

NIR 光谱技术是测定食品或农产品样品中水分、蛋白质和脂肪的可靠工具。定量面粉中蛋白质、水分和灰分2是最常见的用途之一（可追溯到 NIR 光谱法实施之初）。给出的结果是从面粉样品的定量研究中获得的，尤其强调了蛋白质和水分分析的可靠模型的建立。此外，由于这些模型将用在多个手持式NIR microPhazirs分析仪上，因此确定相同类型仪器之间的模型转移效果非常重要。这项工作建立在Dardenne2最近发表的一项研究的基础上，该研究评估了从Foss NIR System 6500到Polychromix手持式Phazir的校准转移的可能性。本文的结果建立在早期的面粉定量模型开发工作上3，然后探讨了校准转移的有效性，以确定在一种仪器上建立的模型的稳健性，以及用于在另一台MicroPhazir上收集和使用数据。

实验步骤

具有蛋白质、水分和灰分参考值的面粉样品来自比利时让布卢的农产品质量部的Pierre Dardenne。由于蛋白质和水分是通过直接参考测量法测定的，而灰分是间接测定的，因此本文仅介绍与蛋白质和水分有关的结果。表1给出了25个参考值的相关统计数据。

表 1: 定标数据集的统计汇总。

所有样品均原样使用，并置于玻璃小瓶中以进行NIR光谱收集。在漫反射模式下，在7台不同的microPhazir上收集光谱，每台microPhazir的波长范围为1595至2395nm。在玻璃瓶的三个位置上一式三份收集光谱，以补偿样品的不均匀性。每个样品总共收集了9个光谱。每个样品也进行了3次测试，期间没有更换，最后每种浓度收集了27个光谱。然后评估光谱数据，并使用Phazir Method Generator (PMG)软件制作定量PLS-1模型。该软件是为与microPhazir一起使用而开发的。

每台microPhazir收集的样品光谱示例如图1所示。

图1: 不同microPHAZIR分析仪上的面粉光谱示例。

除了基本偏移之外，不同microPhazirs测得的所有光谱都相似，没有明显的光谱不一致性。进一步的结果将只用一台microPhazir(microPhazir 1778)进行测定。图2给出了一台microPhazir测定的25个样品中的光谱图：

每台microPhazir收集的样品光谱示例如图1所示。

图2:在一台microPHAZIR分析仪上测定的所有四个样品的光谱。

蛋白质模型开发

使用标准化(SNV)进行预处理以抵消颗粒的不均匀性和密度差异，然后进行Savitsky-Golay平滑算法（一阶导数，5点平滑，二阶多项式）。分别调整用于蛋白质和水分测定的有效波长范围。对于蛋白质，波长限制为1699-1743nm和1960-2293nm。这些区域包括NH的倍频和合频吸收，但忽略了1950nm处的水峰（图3）。

图3:用于蛋白质测定的面粉样品的预处理光谱。

如图4所示，根据因子的散点图结果和交叉验证的相关的均方根偏差(RMSE)，确定了PLS模型最佳选择3个因子。

图4: 用于确定因子的散点图

前三个因子的相关计算图也证实了在生成的PLS模型中三个因子的使用。

所得的PLS模型给出的蛋白质预测的RMSE值为0.28％，RMSECV为0.29％。预测结果给出的R2为0.97，如用于预测25个定标样品中的蛋白质％的相关性图所示（图5）。

图5: 定标数据集的相关性图 - 蛋白质预测。

PLS模型用于预测验证数据集，该数据集由8个面粉样品的子集（分别单独进行收集）组成。所得RMSEP为0.33％蛋白质。定标和验证预测结果的曲线如图6所示。

图6: 验证结果的相关图 - 蛋白质预测。

定标和验证数据集的预测结果的残差图显示了与定标或验证数据相关的蛋白质百分比水平的预期偏差（图7）。

图7: 定标和验证预测结果的残差。

水分分析

从仪器收集的数据还用于生成PLS模型以预测水分。如图8所示，使用基线偏移对microPhazir 1778上收集的光谱进行预处理，并将波长区域限制在显著的水分子基频吸收区(1725-2345nm)。

图 8: 用于水分测定的面粉样品的预处理光谱。

经过预处理后，建立了一个2因子PLS模型，得到的RMSEC为0.22，RMSECV为0.23％（水分）。随后验证子集的预测给出的RMSHP为0.28％，结果如图9所示。

图9: 定标和验证结果的相关性图 - 水分测定。

由于水分会随时间波动，因此不能期望样品保持参考方法所测定的恒定水分含量。因此，仅使用蛋白质结果对此数据进行任何进一步的研究，例如变量的定标转移或影响。通常认为水分结果可用于NIR光谱预测，这些结果可作为概念证据证明面粉中的水分含量很容易预测。

另请注意，蛋白质定量的标准惯例通常涉及样品水分含量恒定（建议为12％）。在本研究中，整个样品集中存在不同量的水分，由于OH谱带的影响，这可能会在数据中引入额外的非线性。

仪器间的定标转移

如前所述，使用了七台microPhazir相互独立地收集数据。先前的讨论涉及使用从一台microPhazir收集的数据进行蛋白质预测。研究的下一阶段是当在与模型开发中使用的不同的microPhazir上进行预测时，评估模型的性能。为此，对数据和microPhazir的可能组合进行了详尽的评估，并计算了相应的RMSEP和偏差。作为基准，在每个单独的microPhazir上建立了一个模型，用于预测在同一microPhazir上收集的数据。这些结果表明，每台特定的microPhazir均可获得最佳的RMSEP，并在表2中显示为单个模型SECV（交互验证标准偏差）。

表2: 第1部分 -蛋白质预测基准SECV (单个仪器); 第2部分- 1778设备作为主机仪器，其他设备作为子机仪器的SECV, 来自定标转移结果。

单个模型SECV的相关误差相对相似，与平均值的标准偏差为0.04％：

图10:单台microPHAZIR仪器的SECV汇总图。

接下来，选择序列号1778的microPhazir作为定标转移的主机仪器。根据在此主机仪器上收集的数据构建的模型可用于预测在其他microPhazir（子机仪器）上收集的数据。定标转移结果见表2的第2部分中。最初的研究表明，模型转移需要进行偏差校正，因为预测标准差(SEP)和偏差都很大。但是，一旦应用了偏差校正，预测误差就会减少到该仪器的最佳值。 偏差也相应地减小到近似为零。这些差异如图11所示，该图显示了在偏差校正之前和之后使用microPhazir 1778预测microPhazir 1783数据的结果：

图11:偏差校正前后的结果图。

利用在子机仪器和主机仪器上收集的样本子集的平均光谱进行简单的偏差校正。在进一步的结果中，确定需要6到8个样本来校正偏差，从而减少每台microPhazir的相关SEP。每台仪器进行均值校正所需的样品数的最终结果如图12所示。

图 12:每台microPHAZIR分析仪进行偏差校正所需的标准样品数。

在选择用于数据平均校正的样本子集时，需要多收集一些浓度较高和浓度较低的点，并且后续样品点都应该包含在此浓度范围内。

总结

事实证明，使用便携手持式NIR仪器预测面粉样品中的蛋白质和水分可提供可靠而可信的结果。较为详细地进行了蛋白质分析，同时在一台仪器上给出了水分测量结果，作为概念证据以证明水分预测可以提供可靠的估计值。在这两种情况下，都实现了可信且可用的预测模型，并且预测误差相对较低。对蛋白质模型在不同仪器之间转移的潜力的研究表明，对于稳健的模型，需要使用6到8个标准样品校正偏差才能校正子机仪器上的结果。这可以通过相对较快地建立在主机仪器上的校正模型来相对较快地实现，并且如校正后的结果所示，当应用偏差校正时，预测误差会大大降低。

参考文献

1. Norris, K.H., Williams, P.C., "Optimization of mathematical treatment of raw near-infrared signal in the measurement of protein in hard red spring wheat. I. Influence of particle size," Cereal Chemistry, 61 (2): 158-165(1984)
2. Osborne, B.G., Fearn, T., "Collaborative evaluation of universal calibration for the measurement of protein and moisture in flour by near infrared reflectance," International Journal of Food Science & Technology, 18: 453-460(1983).

Daredcnne, P., Pierna, J.A.F., Vermeulen, P., Lecler, B., Baeten, V., "Calibration transfer from dispersive instrument to handheld spectrometers," Applied Spectroscopy, 64 (6): 644-648 (2010)