快速、准确、特异性地定量 DNA、RNA 和蛋白质

核酸和蛋白质定量对于下一代测序 (NGS)、 PCR 、转染、免疫印迹、免疫检测等下游应用来说非常重要。Qubit 4 和 Qubit Flex 荧光仪可通过多种 Qubit 检测中检出与靶分子特异性结合的荧光染料,从而对这些靶进行定量。测量结果准确、精确和灵敏,且流程快速而简单。


Qubit 荧光定量技术

Qubit 荧光仪检测 Qubit 检测中与样本中靶分子高度特异性结合的荧光染料。这些染料只有与靶结合时才会发射荧光信号、即使靶分子浓度很低,因此读数也非常灵敏。染料可在数分钟内吸收,并可由 Qubit 荧光仪在数秒内读取,然后将读数内插到标准曲线上。

可选择性结合 DNA、RNA 或蛋白的荧光染料。

Qubit 荧光仪采用专业的曲线拟合算法,使用浓度已知的标样绘制校准曲线。对于 DNA 、 RNA 或蛋白质浓度未知的样本,可通过比较样本与标样的相对荧光单位 (RFU) 而计算浓度。这些测量的检测限特定于每次检测。

Qubit 荧光检测技术具有极高的灵敏度,最少仅需 1 µL 样品,即使样品稀释倍数很高。因此其非常适合定量珍贵的样品。


准确、特异和灵敏

Qubit 4 和 Qubit Flex 荧光仪都可以快速、精确地定量其可检出特异性分子,即使是数量极少。例如、 Qubit 提供 DNA 检测以检测双链或单链 DNA 分子(dsDNA 或 ssDNA)。这些检测对其 DNA 类型来说具有高度选择性,即使存在 RNA、其他类型的 DNA 或常见污染物,包括盐、自由核苷酸、溶剂、洗涤剂或蛋白质。

DNA 定量

此检测中,Qubit dsDNA Hs(高灵敏度)检测具有 0.2–100 ng 的线性检出范围,且对双链 DNA (dsDNA) 具有选择性,即使存在等量的 RNA。

Qubit dsDNA HS 检测的灵敏度和选择性

Qubit dsDNA HS 检测可为已知递增数量的 dsDNA (绿色圆圈)保管准确、线性的结果,即使是在较低含量下(插图,放大了比例尺的最低端)。这些特异于 DNA 的测量仅受单独(红色三角形)或与 DNA 共同(蓝色方块)添加的 RNA 的影响。

通过利用经优化可检出更高 dsDNA 浓度的 Qubit dsDNA HS 检测和 Qubit dsDNA Br(宽范围)检测,我们评价了,我们评价了 Qubit 4 和 Flex 荧光仪以及竞品的准确度和精度。Qubit 仪器的准确度和精度比竞品更高,且 Qubit Flex 仪器的通量更高。

Qubit 荧光仪的准确度和精度。

准确度可通过使用 Qubit dsDNA HS 检测确定相对真实浓度的平均偏差而评价,而精度可使用 Qubit dsDNA BR 检测确定各浓度下重复的变异系数 (CV) 而确定。低偏差百分比证明了 Qubit Flex 和 Qubit 4 荧光仪的准确度,而低 CV 百分比则证明了其精度,特别是对 Qubit Flex 型号来说。在所测试的三台仪器中,竞品仪器的准确度和精度最低。

在 2013 年发表的一篇 PLoS One 文献中,Simbolo 等人报道 Qubit 荧光定量是一种为 NGS 定量各种 DNA 制备物的可靠和高性价比方法,包括冷冻组织及 FFPE 样本中的 DNA。在他们测试过的仪器中,数据显示使用 Qubit 荧光仪获取的 DNA 定量结果有着较高的可重复性,并与 qPCR 方法的 DNA 定量数据相一致,即使是对 FFPE 样品中部分降解的 DNA 来说也是一样。

 

1 Simbolo M, Gottardi M, Corbo V, et al.DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.PLoS ONE.2013; 8: e62692. 全文

RNA 定量

Qubit 提供  RNA 检测 以同时检测完整的大 RNA 分子(如 rRNA 或较大的 mRNA)和完整的小 RNA 分子(如 microRNA 和 siRNA)。这些检测对其 RNA 类型来说具有高度选择性,即使存在 DNA、其他类型的 RNA 或常见污染物。在这项灵敏度检测中,Qubit RNA 和 microRNA 检测的结果均与靶 RNA 的实际浓度相当接近。

Qubit RNA 和 microRNA 检测的准确度和选择性

将 x 轴上所列浓度的核糖体 RNA (rRNA) 添加到含有 2μg/mL siRNA 的样品中。然后 使用 Qubit microRNA 检测 Qubit RNA 检测和通过紫外吸光度定量的 NanoDrop A260 检测对混合物进行检测。计算和显示 8 个重复结果的平均值和标准差。NanoDrop 仪器(紫色条)的总 RNA 浓度检测限是 1.5 μg/mL,影响了其中较低浓度下的准确度和精度。Qubit RNA 检测(红色条)在较大范围内准确定量了 rRNA 浓度。Qubit microRNA 检测(蓝色条)准确定量了 2 μg/mL 的 siRNA 浓度,而随着 rRNA 浓度提高到 2-5 倍时,准确度略受影响。蓝色和红色趋势线分别指示了样本中的 siRNA 和 rRNA 的实际浓度。


比紫外吸收法更灵敏、选择性更高

与可定量在 260 nm 处吸收紫外光的核酸的紫外吸光法相比,Qubit 荧光仪的灵敏度提高了几个数量级。从历史上看,测量紫外吸光度的分光光度计不能区别在该波长下均有吸收的 DNA、RNA、游离核苷酸、过量的盐和其他有机化合物。

 

虽然紫外/可见光仪器上可分析更多光谱的先进软件算法可以成功区分 DNA 和 RNA,但仍不能区分 dsDNA 与 ssDNA 或区分 rRNA 与 microRNA。此外,紫外分光光度法准确测定低浓度的 DNA 和 RNA。

 

注意:尽管紫外吸光法在定量核酸或蛋白质时并没有荧光仪那么灵敏或选择性高,但其非常适合于检测样本中的杂质。许多实验室将这两种技术应用于不同的用途。请前往我们的 RNA/DNA 定量页面对比这两种技术并了解我们 NanoDrop 分光光度计。

与紫外吸光法相比的 Qubit dsDNA 的准确性和灵敏度。

在 Qubit 荧光仪上,用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒按标准试剂盒方案检测已知浓度 0.01-10 ng/μL 的 λ DNA 的 10 个重复。用微体积分光光度计和紫外吸光度测量相同浓度的 10 份重复 DNA(蓝色条),并比较检测结果的准确度和精度。每一条代表 10 个重复的平均值,而误差线(Qubit 的测量值几乎不可见)代表其标准差。x 轴刻度代表在 Qubit 检测管中稀释前起始样品中已知的 DNA 浓度,而 y 轴刻度代表测得的浓度。Qubit 荧光仪的测量值比紫外吸光法更准确 (y » x)、灵敏(低浓度,插图)和精确(更短的误差线)。

“我们的数据强烈支持定量适合 NGS 的组织病理学样本中 DNA 的理想工作流程是首先使用 NanoDrop 评估样本中是否存在污染物,然后使用 Qubit 定量 dsDNA 。”

 

组织病理学样本下一代测序的 DNA 定量工作流程²

Simbolo, Gottardi, Corbo, et al.(2013)

2.Simbolo M, Gottardi M, Corbo V, et al.DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS ONE. 2013; 8: e62692. 全文


简单、快速

Qubit 荧光仪操作简单、轻松:只需按屏幕上显示的详细说明操作即可。甚至还有一个内置计算器,可根据检测的样本和标样量来确定要使用的染料和缓冲液的确切数量。此视频演示了简单直观的流程。

 

分离 DNA 、 RNA  或蛋白质样本后,按推荐比例将它们与染料和缓冲液混合,然后移液到检测管或联管中。按相同方式制备可用于多个样本的两(或三)个标样。开始测试后,仪器只需几秒钟即可报告结果。

 

然后您可通过 WiFi 将结果导出到 Thermo Fisher Connect 云帐户,或者通过 USB 驱动器或线缆将标准 CSV 文件传输到计算机。

 

如果您的样本数很多,可使用 Qubit Flex 荧光仪以提高通量。图中显示了使用 Qubit 4 或 Flex 荧光仪以及竞品仪器检测给定数量的样本的数据采集时间,包括样品制备和测量时间。

Qubit Flex 荧光仪可最多节省 50% 的数据采集时间。

一项时间对比研究利用 Qubit 1X dsDNA HS 检测试剂盒比较了 Qubit Flex 荧光仪、Qubit 4 荧光仪以及其他供应商的荧光仪。结果表明,在检测最多 96 份样本时,可将数据采集时间最多缩短 50%。

提示:高通量定量应考虑使用具有荧光功能的微孔板酶标仪。

Thermo Scientific Fluoroskan 微孔板荧光仪 和 Varioskan LUX 多模式微孔板酶标仪 兼容 Quant-iT 检测 ,可定量 Qubit 荧光仪和检测的分析物。有关对比信息,请参阅我们的 RNA/DNA 定量页面


用于样品制备和下游应用的内置计算器

所有 Qubit 荧光仪都内置试剂计算器,可帮助您根据检测样本和标样的数量确定制备工作溶液所需的试剂和缓冲液量。它可用于确定样本和标样的主混合体积。

内置试剂计算器

试剂计算器可根据您检测的样本和标样量而确定制备足够工作溶液所需的染料、试剂和缓冲液体积。您甚至可以包括冗余,以确保您不会在运行时出现短缺。

为了优化您的工作流程,Qubit Flex 荧光仪额外提供三个计算器。为您选择的检测制备样品时,检测范围计算器可根据您的样品量显示最准确的核心样品浓度范围以及扩展的高低浓度范围。

检测范围计算器

此计算器可帮助您选择在可用样本量和浓度下实现最佳准确度的 Qubit 检测。

摩尔浓度计算器

使用此计算器可快速通过样本浓度和大致碱基对长度而确定摩尔数。

归一化计算器

该计算器可快速确定归一化所有样品到相同浓度、质量或摩尔浓度和体积所需的样本与缓冲液量。

为了帮助您过渡到下游应用,特别是 NGS ,有两个计算器可帮助您管理检测样本数据以及完成常用单位转换和稀释。摩尔浓度计算器允许您根据核酸长度和测量浓度确定样品的摩尔浓度。在测序应用中,归一化计算器可替代库准备过程中经常用于样本归一化的电子表格。每次运行时,它可建议添加多少样本和缓冲液以达到所需的归一化质量、浓度或摩尔浓度。两个计算器的结果都可轻松地通过 Wi-Fi 直接导出到 Thermo Fisher Connect 云账户,或者通过 USB 驱动器或以太网电缆以标准 CSV 文件格式导出到计算机或其他设备。


宽广的检测和应用范围

核酸定量对于下游 DNA 和 RNA 应用来说非常重要,例如 NGS、RNA 测序、PCR、qPCR、克隆、 质粒制备和转染。蛋白质定量分析对蛋白质电泳、蛋白质免疫印迹、质谱分析和免疫检测等应用来说至关重要。

 

Invitrogen Qubit 检测使用靶选择性染料,只有与 DNA 、 RNA 或蛋白质结合时才会发射荧光。荧光测量法相对紫外吸光或 Bradford 检测等其他方法更灵敏、特异性更高,而后两种方法会因盐、溶剂、洗涤剂、蛋白至以及游离核苷酸等污染物的影响而过高估计样品浓度。

 

Qubit 检测可用于多种定量应用:

DNA 定量

Qubit DNA 检测对两个不同浓度范围内的 dsDNA 以及 ssDNA 和寡核苷酸均具有高度特异性。

RNA 定量

Qubit RNA 检测可测量三个不同浓度范围的大 rRNA 和 mRNA 分子,或 microRNA 等小 RNA 分子。

RNA 完整性和质量 (IQ)

计算完整和 / 或结构化大 RNA 分子与降解后小 RNA 分子比例的独家定量检测。

蛋白质定量

Qubit 蛋白质检测可以快速检测两种不同浓度范围内蛋白质的含量,其范围均比传统的 Bradford 蛋白定量检测更宽。

Ion Sphere 质量控制试剂盒

专为在 Ion Personal Genome Machine (PGM) 或 Ion GeneStudio 系统上测序之前评估所富集 Ion Sphere 颗粒 (ISP) 而设计。

自定义 MyQubit 检测(仅限 Qubit 4)

为 Qubit 4 荧光仪创建您自己的定量检测。


荧光仪模式和 MyQubit 自定义检测

在“荧光仪”模式下、 Qubit 荧光仪可作为小型荧光仪使用。该仪器会为每个样品生成和显示原始荧光单位 (RFU) 值,而不是根据算法校准检测和计算结果。

 

在“荧光仪”模式下、您可以选择蓝色或红色 LED 作为激发源。如果您选择蓝色激发光,该仪器就会读取绿色和远红外发射通道上的荧光值。如果您选择红色激发光,则只会读取远红外通道中的发射。

荧光仪模式

按下主屏幕上的荧光仪即可进入“荧光仪”模式。选择要使用蓝色 (470 nm) 或红色 (635 nm) 激发光源。插入样本并选择读取试管后,结果将在屏幕上显示(单位:RFU)。

MyQubit 检测

在 Qubit 4 的荧光仪模式下收集的数据可用于通过 MyQubit 检测设计工具来设计您自己的检测。这一工具可让您在数分钟内为 Qubit 4 荧光仪创建新的自定义检测。您只需将检测参数输进在线工具,然后用 USB 驱动器保存并上传 .qbt 文件至 Qubit 荧光仪。

 

预配置 MyQubit 检测可定量胆固醇、半乳糖、葡萄糖、谷氨酸、过氧化氢或蔗糖。您可下载这些 .qbt 文件到计算机,然后用 USB 驱动器上传至 Qubit 4 荧光仪即可。以下是您可自行创建的 MyQubit 检测的类型。


仅供科研使用。不可用于诊断程序。