介绍

组织巨噬细胞源自于单核细胞。从血液中分离细胞并在含血清的培养基中培养，贴壁的单核细胞就会分化为巨噬细胞。在巨噬细胞培养中，我们建议您加入 M-CSF 。加入 IL-4、IL-10 或 TGF-β 等其他细胞因子有助于提高细胞存活。以下方案适用于 T25 或 T75 烧瓶，但可等比例缩小到 100 mm 培养皿或培养板。


材料


步骤

  1. 在无菌条件，从全血中分离 PBMC（见下面的补充方案 A）。
  1. RPMI 1640 完全培养基的配制：加入胎牛血清（最终浓度达 10%）和 2 mM 左旋谷氨酰胺到 RPMI 1640 培养基（如果使用目前未用 GlutaMAX 补充的培养基） 。使培养基的温度达到 37°C。可选：添加 1% 的青霉素-链霉素（5000 单位/mL）。
  1. 重悬细胞于 RPMI 1640 完全培养基中，使细胞浓度达 2 x 106 个细胞/mL。
  1. 将细胞溶液转移到细胞培养皿中。
  1. 在37°C 、 5% CO2 的培养箱中培养 24 小时，使单核细胞贴壁。
  1. 在无菌锥形管中，制备含40-50 ng/mL M-CSF 的RPMI 1640 完全培养基。可选：加入 20 ng/mL 的 IL-4。
  1. 用含 M-CSF 和 IL-4（如添加）的培养基替换培养皿中的培养基。
  1. 在 37°C 、 5% CO2 的培养箱中培养细胞 6 天。在这 6 天内，每隔 3–4 天，补充 含40–50 ng/mL M-CSF 的 RPMI 1640 完全培养基（可选：加入 20 ng/mL 的 IL-4 ）。用显微镜检查细胞健康和生长密度。
  1. 当细胞质中出现很多颗粒，且细胞略有伸长时，就可以收集细胞。此外，大量的细胞应贴附于培养板上。当收集细胞时，丢弃旧培养基，用 1X PBS 冲洗培养皿两次，每次冲洗后都丢弃 PBS。
  1. 向每个培养皿加入 10 mL 10 mM EDTA，在室温静置 10 分钟或直到细胞不再贴附于培养皿。
  1. 将细胞收集在 50 mL 锥形管中，在室温下 300–400 x g 离心 4-5 分钟。
  1. 丢弃上清液，并用 1X PBS 冲洗细胞。
  1. 300–400 x g 离心 4-5 分钟。
  1. 丢弃上清液，用流式染色缓冲液或培养基重悬细胞。

方案提示：

在 Nunc UpCell 培养皿上培养单核细胞，有助于保持细胞活性并保留表面蛋白。Nunc UpCell 通过降低培养皿表面温度实现细胞收集，无需分解酶（例如胰蛋白酶、EDTA），从而保留了细胞膜和表面的受体。


补充方案 A：从全血中分离 PBMC

材料

步骤

  1. 在锥形管中，按至少 1:1 的比例用 PBS 稀释血液样本。
  1. 在稀释的样本中，加入与原始样本等体积的 Ficoll-Paque® 。
  1. 在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
  1. 将 PBS 和 Ficoll-Paque® 层交界处的 PBMC 收集至新的试管中。
  1. 向试管中加入 PBS，洗涤细胞。
  1. 在2-8°C 下300-400 x g 离心 4-5 分钟，丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞，然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤6对细胞进行离心，然后用适量的 RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，使细胞终浓度达到 2 x 106 个细胞/mL。

注意：

如果细胞将用于培养，全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

方案提示：

使用自动计数仪显著提高对单核细胞健康和浓度评估的准确度。有关如何使用 Countess II FL 自动细胞计数仪对 PBMC 进行计数， 见详细方案。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。