基因编辑技术的原理在于，人工核酸内切酶能够识别并切断靶DNA序列，产生DNA双链断裂（Double-strand break，DSB），然后细胞进行及时修复，主要有两种修复途径：非同源末端连接（Non-homologous end joining, NHEJ）和同源重组（Homologous directed repair, HDR）。通过NHEJ修复DSB时，细胞常会在断裂位点插入或删除几个碱基(indel)，快速将DNA连接起来，因此导致的基因序列变化而使修复后的基因突变，功能丧失，称之为基因敲除（Knock out，KO）；通过HDR修复DSB时，细胞修复系统会将额外提供的一个与靶DNA两侧同源的外源片段作为模板，在DSB处合成与同源序列互补的基因序列，由于外源片段中携带待敲入的突变或目的基因，因此就可以在基因组中精确地引入点突变，或者插入目的基因，称之为基因敲入（Knock in，KI）。

探索基因编辑工具基因敲除（KO）正是利用基因编辑技术中DNA双链断裂（DSB）后发生的非同源末端连接（NHEJ）修复途径来实现的。 其核心原理在于：设计的人工核酸内切酶（如CRISPR-Cas9系统）能精确靶向并切割目标基因的关键区域，产生DSB。细胞在紧急修复这种断裂时，若采用NHEJ途径，会直接在断口处进行“粗糙”的连接。这个过程极易在连接点附近引入小片段的碱基插入或删除（Indel），导致目标基因的编码序列发生移码突变或提前产生终止密码子，从而破坏该基因的功能蛋白表达，最终实现对该基因的“敲除”或失活。

基因敲除技术原理图

基因敲除步骤：

  1. 分析敲除基因，确定敲除靶标位点；
  2. 设计并合成识别靶标位点的sgRNA；
  3. 构建基因敲除载体；
  4. 构建基因敲除细胞株:依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式（脂质体、电转或病毒包装）；
  5. 将抗生素素筛选后分离的细胞克隆进行测序验证；
  6. 96孔板进一步筛选单克隆并测序，选择敲除纯合细胞株。

基因敲除常见问题解答：

基因敲除Knock-Out和删除Deletion实验有什么区别？

  • 敲除实验将为您提供 gRNAs 设计的多种选择，引入小的插入和缺失 (indels)导致移码突变，或者插入多个STOP密码子来终止转录。这两种方法都可以实现功能性敲除。
  • 删除实验利用一个 gRNA 和一个 ssDNA 供体精确地删除多达 30 个碱基的特定基因组区域。例如，删除某个特定氨基酸。尽管这可以用作功能性敲除的策略之一，但它是专为精确编辑目标基因而设计的。

有哪些工具可用于基因敲除实验的sgRNA设计？

如何选择合适的Cas9蛋白来完成基因敲除实验？

赛默飞提供TrueCut Cas9 蛋白家族，与向导 RNA (gRNA) 结合，以形成功能性的、靶向特异性的编辑复合物，包括TrueCut野生型Cas9蛋白，TrueCut高保真Cas9蛋白，可用于细胞治疗的CTS级别Cas9蛋白。

如何使用 STOP 密码子进行基因敲除Knock-Out？

  • 当选择敲除实验类型时，您将看到插入 STOP 密码子的选项，这是实现功能性敲除的方法之一。这个策略使用一个 gRNA （造成双链 DNA 断裂）和一个 ssDNA 供体在转录起始位点插入多个终止密码子。这会干扰目标蛋白的翻译。

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仅供科研使用，不可用于诊断目的。