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用于 Sanger 测序的 PCR
用于 Sanger 测序的 PCR 设置
PCR 用于在 Sanger 测序前对目标 DNA 区域扩增。PCR 反应物由以下5种组份组成。
PCR 组分1：引物对
应用我们的 Invitrogen™ Primer Designer 工具，选择并订购设计好的 PCR 和 Sanger 测序引物对，以更快、轻松地获取 PCR 引物，该工具为一个约650,000对人类外显子组和线粒体基因组在线靶向引物集
图1.使用 PCR 引物和
标准引物末端进行测序
标准引物末端进行测序
为了设计出色的 PCR 引物，请遵循以下建议：
- 引物应特异性靶向目标序列，且不含内部二级结构
- 引物不应包括延伸的多碱基序列（如，poly (dG)）或重复的基序，因为这些基序可能会与模板不当杂交
- 引物对应具有兼容的融解温度（5℃以内），并含有约 50% 的 GC 含量。高 GC 含量会导致产生稳定的不适当杂交产物，而高 AT 含量会降低完全匹配杂交产物的融解温度。如果可能的话，引物的 3' 端应富含 GC 碱基（GC 发卡）以增强延伸末端退火，但不应超过3个 G 或3个 C
- 序列分析应避免互补，以防止引物（引物-二聚体）杂交（图1）
引物设计软件
OligoPerfect 软件等引物设计软件可以自动评估靶标序列，并根据上述标准设计引物。为了确定引物的特异性，可以采用公共数据库进行 BLAST® 搜索，以确保引物只识别特定靶标。
通用加尾引物
您可以合成一个在5'端添加一个通用测序引物结合位点的 PCR 引物。通用加尾 PCR 引物可用于以下情形：
- 结合染料化学终止剂（通用测序引物具有良好的退火特性）
- 与市售染料标记的测序引物结合使用
- 对得到的 PCR 产物进行测序，以简化和标准化测序步骤（这是 Applied Biosystems™ BigDye Direct Cycle 循环测序试剂盒采用的策略）
为什么采用 M13 加尾 PCR 引物或其他通用加尾引物？
图2.使用 PCR 引物和
标准引物末端进行测序
标准引物末端进行测序
对于大多数大型项目，在 PCR 引物上添加一个标准（通用）引物尾部以简化测序设置已成为惯例（图1）。较常见的尾部是 M13 序列，因为它起初用于对单链噬菌体 M13 构建的克隆进行测序。使用加尾 PCR 引物的潜在缺点是在设计带尾引物时面临更大的挑战，而且由于引物（PCR 引物）长度增加，需要更高质量的寡核苷酸。我们针对长达45个碱基的引物提供优良的引物设计工具和具备吸引力的价格。
使用 M13 加尾引物或通用加尾引物的主要优点是测序反应构建简单（图2）。
PCR 组分2：DNA 聚合酶
PCR 的性能往往与 DNA 聚合酶有关，因此酶的选择是成功的关键。影响 PCR 特异性的主要因素之一是 Taq DNA 聚合酶在低温下仍具有残留活性。引物可以非特异性地退火 DNA，使得聚合酶合成非特异性产物。这种副作用可以通过引入热启动酶来尽可能减少影响。使用热启动酶有助于确保在反应构建和初始 DNA 变性步骤中不存在活性 Taq。
PCR 组分3：MgCl2
MgCl2 是 Applied Biosystems™ AmpliTaq™ DNA 聚合酶的一种辅助因子，对酶的良好活性至关重要。MgCl2 可与 dNTPs 螯合，所以 dNTP 和 MgCl2 浓度需要同时增加。
PCR 组分4：缓冲液
该酶附带优化的缓冲液。
图3.在 PCR 反应过程中由引物二聚体的形成引起的重复序列的示例。引物二聚体退火并填充以产生短的非模板 PCR 产物。通过确保引物设计良好并加入热启动酶，可以显著减少这些伪影。
PCR 组分5：添加剂
也可加入一些其他添加剂，以便扩增复杂模板（例如，针对富含 GC 的模板添加 DMSO）。
执行 PCR 反应
PCR 反应由三个主要步骤组成。反应通常进行30个循环。
- 变性—温度应与选择的聚合酶相适应（通常为 95℃）。如果模板 GC 含量高，则可增加变性时间。
- 退火—根据计算出的引物融解温度 (Tm) 使用适当的温度（引物 Tm 以下 5℃）。
- 延伸—在 70℃-72℃ 时，DNA 聚合酶的活性优秀，引物以每秒100个碱基的速度延伸。
PCR 扩增子通常使用琼脂糖凝胶电泳法评估。为了获得良好的测序反应，PCR 产物应在琼脂糖凝胶上以单条带形式出现。多个条带表示序列重复（图1）。
PCR 纯化
PCR 纯化的目的是去除多余的 PCR 引物（每个测序反应使用一个引物）和 dNTP（保持 Applied Biosystems™ BigDye™ 循环测序反应所必需的 dNTP 与 ddNTP 比例）。纯化 PCR 产物的方法有多种。根据 PCR 反应物所含成分数量和您计划使用的测序化学试剂，选择一种方法：
- 超滤
- 乙醇沉淀
- 凝胶纯化
- 酶纯化：包括虾碱性磷酸酶 (SAP) 和外切酶 I (Exo I) 测序前处理；SAP/Exo I 法降解 PCR 后剩余的核苷酸和单链 DNA（引物）
重要提示! 如果存在多种 PCR 产物，柱纯化、乙醇沉淀或酶纯化法都不能分离出所需的产物。使用凝胶纯化分离所需产物或重新优化 PCR，以获取单一产物。如果 PCR 污染产物比所需的 PCR 产物要少得多，超滤法可能适用。
片段分析：构建 PCR 反应
大多数 Applied Biosystems™ GeneScan™ 大小标准片段分析实验的成败取决于 PCR 扩增步骤的成败。
PCR 组分1：引物对
一对 PCR 引物对由两个寡核苷酸组成，通常长度为15-30个核苷酸，与 DNA 模板互补链杂交并在感兴趣区域的侧翼。其中一条引物用荧光染料标记，这样一来，在基因分析仪上进行毛细管电泳 (CE) 时，便可检测到 PCR 产物。这种双参数方法（荧光标记和片段大小）可通过单次毛细管进样分析许多独立位点。为在一次 CE 运行中较大限度采集数据，可使用显色不同的染料组合，并可以通过相同的虚拟滤器组合检测（见下表）。
| 当 DNA 样本片段用以下染料标记时 | 选择用以下染料标记的大小标准品 | Applied Biosystems 染料集 | 可能的应用 | 相关的 Applied Biosystems 试剂盒和产品 |
|---|---|---|---|---|
| dR110、dR6G、dTAMRA™、dROX | LIZ™ | DS-02 | SNaPshot™ 试剂盒 | SNaPshot™ 引物聚焦试剂盒、SNaPshot™ 多重分析试剂盒 |
| 5-FAM™、HEX™、NED™ | ROX™ | DS-30 | 定制寡核苷酸 | |
| 6-FAM™、VIC™、NED | ROX | DS-31 | 微卫星 | 定制寡核苷酸 |
| 5-FAM、JOE、NED | ROX | DS-32 | 微卫星（法医学） | AmpFlSTR™ Profiler Plus™、COfiler™、SGM Plus™ 试剂盒、StockMarks™ 试剂盒 |
| 6-FAM、VIC、NED、PET™ | LIZ | DS-33 | 微卫星（法医学） | AmpFISTR™ Identifiler™ 试剂盒、AmpFISTR™ Yfiler™ 扩增试剂盒、定制 StockMarks™ 试剂盒 |
| 6-FAM、TET、HEX | TAMRA™ | DS-34 | ||
| 6-FAM、dR6G | LIZ | DS-40 | SNP 基因分型 | SNPlex™ 基因分型系统 |
Plus A Artifact
“plus A”峰是 PCR 扩增的一个假象，起因为添加了未模板化的 A 核苷酸。Plus A 假象增加了峰图的复杂性，使得识别真正的等位基因峰变得更加困难。反应条件可大幅影响这一位置依赖性假象。当复制 DNA 链的聚合酶将一个额外的碱基 (plus A) 添加到序列的末尾时，就会发生 plus A 假象。添加的 plus A 百分比 (0-100%) 取决于 PCR 产物最后7个碱基。分析结果时，必须保证 plus A 峰高于等位基因峰。当等位基因峰和等位基因 plus A 峰的高度基本相等时（图4），等位基因识别就会产生不确定结果，大约5-10%的标记物会发生这种情况。
通过消除与未模板化核苷酸添加相关的问题，定制加尾引物对所采用的专利反向引物加尾化学法可提高等位基因检出效率。引物加尾方法之所以有效，是因为它控制了聚合酶与双链 DNA 末端结合处的上下序列，添加了未模板化的核苷酸。加尾反向引物包含一个7碱基序列，其以接近100%的比例产生 plus A 产物。
良好的 PCR 引物设计建议包括：
- 引物应特异性靶向目标序列，且不含内部二级结构
- 引物不应包括延伸的多碱基序列（如，poly (dG)）或重复的基序，因为这些基序可能会与模板不当杂交
- 引物对应具有兼容的融解温度（5℃以内），并含有约 50% 的 GC 含量。高 GC 含量会导致产生稳定的不适当杂交产物，而高 AT 含量会降低完全匹配杂交产物的 Tm。如果可能的话，引物的3'端应富含 GC 碱基（GC 发卡）以增强延伸末端退火，但不应超过3个 G 或3个 C
- 序列分析应避免互补，以防止引物（引物-二聚体）杂交
引物设计软件
OligoPerfect 软件等引物设计软件可以自动评估靶标序列，并根据上述标准设计引物。 为了确定引物的特异性，可以采用公共数据库进行 BLAST 搜索，以确保引物只识别特定靶标。
图4.反向引物加尾化学法可改善等位基因识别结果。在此示例中，峰106是未加尾产物中的等位基因峰。由于等位基因峰和等位基因 plus A 峰(107)高度相似，Applied Biosystems™ GeneMapper™ 软件可能无法正确识别等位基因。这种类型的数据通常需要手动编辑，以避免在未使用反向引物加尾化学法时出现等位基因检出结果丢失或错误的情况。相比之下，在加尾产物中，114峰是等位基因峰 plus A 峰，该峰多了8个碱基，因为其包括7碱基尾和额外的 A。未加尾等位基因峰完全消失，从而有助于通过软件算法进行分析。
PCR 组分2：DNA 聚合酶
PCR 的性能往往与 DNA 聚合酶有关，因此酶的选择是成功的关键。影响 PCR 特异性的主要因素之一是 Taq DNA 聚合酶在低温下仍具有残留活性。引物可以非特异性地退火 DNA，使得聚合酶合成非特异性产物。这种副作用可以通过引入热启动酶来尽可能减少影响。使用热启动酶可确保在反应构建和初始 DNA 变性步骤中不存在活性 Taq。AmpliTaq DNA 聚合酶是一个良好的选择。
PCR 组分3：MgCl2
MgCl2 是 AmpliTaq 聚合酶的一种辅助因子，对酶的良好活性至关重要。MgCl2 可与 dNTPs 螯合，所以 dNTP 和 MgCl2 浓度需要同时增加。
PCR 组分4：缓冲液
该酶附带优化的缓冲液。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。