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稳定细胞系构建
建立稳定细胞系是在许多研究应用中至关重要的一步，包括用于长期基因调控研究、基因治疗中的持续表达，以及在生物技术与生物制药领域进行大规模蛋白生产。选择合适的抗生素对成功尤为关键，因为它们可为多样化的研究需求提供有效方案，例如双重筛选以及快速建立稳定细胞系。本指南将带您了解成功构建稳定细胞系的关键步骤与注意事项，从最初的抗生素选择到最终筛选获得耐药克隆。
用于稳定细胞系构建的抗生素选择
用于稳定细胞系构建的筛选抗生素种类繁多。所选择的抗生素取决于转染实验中使用的抗生素抗性基因或筛选标记。
赛默飞世尔科技提供高品质的筛选试剂，可与我们丰富的真核表达载体配套使用。Geneticin（G418 硫酸盐）、Zeocin、潮霉素 B（Hygromycin B）、嘌呤霉素（Puromycin）和 博来霉素（Blasticidin） 是稳定细胞转染中最常用的筛选抗生素。这些抗生素可为您的研究需求提供多样化解决方案，例如双重筛选以及快速建立稳定细胞系。
稳定细胞系构建流程
稳定转染细胞的筛选始于成功将含有筛选标记（如抗生素抗性基因）的质粒导入细胞。作为阴性对照，应使用不含该筛选标记的 DNA 转染细胞。
构建稳定细胞系的建议：
- 确保所用细胞系能够由单个细胞形成克隆；某些细胞需要彼此接触才能生长，对于这类细胞，使用适应培养基或条件培养基可能更有利。
- 选择合适的筛选标记
- 选择适用于您的细胞类型的转染方法
- 通过建立剂量-反应曲线（杀灭曲线，kill curve）来确定该细胞类型的筛选条件；详见下文杀灭曲线实验步骤。
抗生素杀灭曲线（Kill curve）实验步骤
需要注意的是：对于每种细胞类型，以及每次使用新的筛选抗生素批次时，都应重新建立杀灭曲线。请按以下步骤生成杀灭曲线：
- 将一皿汇合生长（confluent）的细胞按约 1:5 至 1:10 的比例传代（具体取决于细胞类型及转染后的细胞密度），并接种至含有不同浓度抗生素的培养基中。
- 将细胞培养10 天，每 4 天更换一次筛选培养基（或按需更换）。
- 使用合适的方法检测培养皿中的存活细胞（例如使用Countess 自动细胞计数仪，或采用台盼蓝染色结合血细胞计数板进行计数）。
- 绘制“存活细胞数量-抗生素浓度”关系图，建立杀灭曲线，以确定能够杀死未转染细胞的最佳筛选药物浓度。
稳定细胞系构建基本流程
1. 转染细胞
采用合适的转染方法对细胞进行转染。如果筛选标记位于单独的载体上，则含目的基因的质粒与含筛选标记的质粒应按 5:1 至 10:1 的摩尔比进行共转染。
注：应使用“含筛选标记但不含目的基因”的载体进行对照转染。如果对照质粒转染的细胞可形成克隆，而含目的基因的质粒转染却无法形成克隆，说明目的基因可能具有毒性。此外，建议进行重复转染，以防转染失败。
2. 抗生素筛选传代
转染后 48 小时，在含适当筛选药物的培养基中按不同稀释比例（如 1:100、1:500）传代。为获得有效筛选，细胞应处于未达汇合（sub confluent）状态，因为处于汇合且不再增殖的细胞对 Geneticin 等抗生素具有耐受性。悬浮细胞可在软琼脂中筛选，或在 96 孔板中进行单细胞克隆筛选。在接下来的两周内，每 3–4 天更换一次含药培养基（或按需更换）。
注：悬浮培养中细胞密度较高时会导致频繁换液，从而可能耗尽关键的可溶性生长因子，降低细胞活性与体系效率。
3. 观察是否出现明显的“细胞岛”
在第二周期间，观察是否出现由存活细胞形成的明显“细胞岛”。根据细胞类型不同，耐药克隆通常会在 2–5 周内出现。在使用阴性对照质粒转染的培养中，细胞应在 3–9 天内死亡。
4. 分离克隆
使用克隆环（cloning cylinders）或无菌牙签分离较大（约 500–1,000 个细胞）且健康的克隆，并继续在含适当筛选药物的培养基中维持培养（关于悬浮培养中克隆分离，可参见 Freshney《Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications》，Wiley-Blackwell，纽约）。
5. 转移单细胞
将耐药克隆中的单个细胞转移到 96 孔板的孔内，以确认其能够形成具有抗生素抗性的克隆。转移后务必确保每孔仅有一个细胞。
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稳定细胞系构建常见问题（FAQs）
什么是稳定细胞系？
稳定细胞系是指经过基因修饰后，能够在多代传代过程中持续稳定表达特定目的基因的细胞群体。这些细胞能够维持外源遗传物质而不丢失，因此非常适用于长期研究与蛋白生产。
如何构建稳定细胞系：
要构建稳定细胞系，可将携带目的基因与筛选标记的载体转染入细胞。转染后，施加筛选压力以清除未转染细胞，并分离稳定表达目的基因的克隆；随后扩增这些克隆，以获得均一的细胞系。
稳定细胞系与瞬时表达细胞系有什么区别？
稳定细胞系是指将外源转染的 DNA 整合到细胞基因组，因此该遗传物质可在细胞分裂过程中传递，从而实现长期稳定的基因表达。瞬时表达细胞系则仅在短期内表达转染基因，且外源DNA不会整合到细胞基因组中。此外，稳定细胞系的建立需要使用筛选标记与抗生素，以筛选出成功整合目的基因的细胞；而瞬时表达细胞系通常不需要筛选，更适合功能实验、快速蛋白表达等短期研究。
构建稳定细胞系需要多长时间？
根据具体流程以及各步骤效率不同，建立稳定细胞系通常需要几周到数月不等。
筛选通常在转染后约 48 小时开始，此时对细胞进行筛选，并在接下来的约 2 周内维持筛选培养。非获得抗性的细胞一般在 3–9 天内死亡；根据细胞类型不同，耐药克隆可在 2–5 周内出现。验证基因成功整合与表达还可能需要额外 1–2 周时间。具体信息请以产品说明书为准。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。