内皮细胞血管生成测定

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血管生成测定是构建血管新生重组阶段最广泛使用的体外测定之一。这种测定方法测量的是内皮细胞在适当的细胞外基质支持下，以亚汇合密度培养时形成毛细管样结构（又称血管）的能力。科学家通常采用这种测定来确定各种化合物促进或抑制血管生成的能力。能够抑制血管生成的化合物可用于各种疾病，例如癌症，肿瘤刺激新血管形成，以获得氧气和营养物质，从而在相对较小的范围内继续生长。

在培养过程中，内皮细胞在周围的细胞外支持基质上附着并产生机械力，以创建促进细胞迁移的追踪或引导途径。由此产生的细胞索最终将形成中空的管腔。

目前的研究重点是“基质-整合素-细胞骨架信号轴”中的特定分子如何参与最终组装成三维血管网络。¹ 形成后，这些相互连接的网络通常保持大约 24 小时。通常通过测量培养皿二维显微镜图像中这些毛细管样结构的数量、长度或面积来量化血管生成。
这种测定方法的优势是：设置相对简单、所需培养时间短、可量化、适用于高通量分析。这种测定方法的缺点是，不同批次的内皮细胞和支持基质的血管生成能力差异很大，因此选择这些资源对于获得一致且可靠的数据至关重要。虽然这种测定方法至关重要，但使用者应谨慎确定，应在体内确认结果，因为已针对其增殖能力预先选择了市售内皮细胞，不存在异源特异性细胞相互作用。也有文献报道，某些非内皮细胞类型显示血管生成，这表明内皮细胞的血管生成可能并不代表这种细胞类型的真正分化。²

所有程序均应在生物安全柜中使用无菌技术进行，以防止污染。

第 0 天

1.通过解冻一瓶低血清生长添加剂 (LSGS) 并将 LSGS 瓶的全部内容物转移至 培养基 200PRF，制备一瓶补充添加剂的培养基 200PRF。

• 备注：  培养基 200PRF 添加 LSGS 后，补充添加剂的培养基应在 4°C 条件下避光储存，不应冷冻。当在 4°C 条件下避光储存时，补充添加剂的培养基可保持稳定 1 个月。

2.使用 LSGS 补充培养基 200PRF（总体积 15 mL），每一个 75 cm² 的组织培养瓶可在 2 × 10⁵ 个活细胞下接种冻存内皮细胞 (HUVEC)。

3.接种后 24-36 小时更换培养基。

4.此后每隔一天更换培养基，直到培养物达到约 80% 的融合度（5-6 天）。

第 5 天

5.将 Gibco Geltrex  在冷藏冰箱 (4°C) 中解冻过夜。

• 备注： 由于冰箱温度可能会有所不同，因此在冷藏冰箱中的冰槽中解冻 Geltrex。

第 6 天

6.使用细胞可透过性染料（如 Invitrogen Calcein，AM）对血管生成进行荧光监测的可选步骤：向 75 cm² 培养瓶中的内皮细胞中加入染料，在 37°C 和 5% CO₂ 下孵育 30 分钟（避光）。最终染料浓度应为 2 µg/mL。

7.向生长表面添加 50 – 100 µl 的 Geltrex 并在 37 °C 下孵育包被表面 30 分钟，以便凝胶固化。

• 备注：  每 cm² 的 50 µL 的 Geltrex 足以用于较大的孔径（例如 12 孔、24 孔）。 对于较小的孔径（例如 96 孔），每 cm² 需要 100 µL。

8.采用以下程序收集细胞。 使用前，请勿对以下任何试剂进行加热。 本程序设计用于一个 75‑cm² 培养瓶。如果使用不同大小的培养皿，请相应调整试剂量：

• 从培养瓶中取出所有培养基。
• 向 75‑cm² 培养瓶中加入 12 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液。 摇晃培养瓶，以确保覆盖整个表面。
• 立即从培养瓶中取出 9 mL 胰蛋白酶/EDTA 溶液。
• 将培养瓶在室温下孵育 1-3 分钟。
• 在显微镜下观察培养物。
• 当细胞完全变成圆形时，轻轻敲击培养瓶，使细胞从培养瓶表面掉落。
• 向培养瓶中添加将 9 mL 胰蛋白酶中和剂溶液，并将分离的细胞转移到无菌 50 mL 锥形管中。
• 向培养瓶中添加 9 mL 额外的胰蛋白酶中和剂溶液，并将溶液在培养瓶表面吸取数次，以去除任何残留的细胞。
• 将此溶液添加到 50 mL 锥形管中。
• 将细胞以 180 × g 离心 7 分钟，直到细胞沉淀。
• 从试管中取出上清液，注意不要移出细胞沉淀物。

9. 向细胞沉淀物中加入 4 mL 未补充添加剂的培养基 200PRF，然后上下移液几次以确保均一的单细胞悬液。

10.使用未补充添加剂的培养基 200PRF 测定细胞浓度。

11.在存在或不存在血管新生诱导剂和抑制剂的情况下，将细胞稀释于未补充添加剂的的培养基中。 我们建议将每 200 µL 3.5-4.5 × 10⁴ 个细胞的浓度作为起点和一般指南；理想的铺板密度和培养基体积取决于细胞类型，并且应通过实验确定。最终培养基体积应为 ~200 µL/cm²。

• 备注：  对于阳性诱导剂对照，我们建议在 LSGS 补充培养基 200PRF 中稀释细胞。 LSGS 补充培养基 200PRF 包含 2% (v/v) FBS 和 bFGF (3 ng/mL)。 对于阳性抑制剂对照，我们建议使用 LSGS 补充培养基和 30 µM 苏拉明稀释细胞。

12.将选定密度的细胞添加到凝胶涂层孔中，最终培养基体积约为 ~200 µL/cm²。

13.将反应板于 37°C、5% CO₂ 下孵育过夜。

• 备注：  孵育时间可能会有所不同。例如，HUVEC 在 4-6 小时后形成良好的管网。 24 小时后，内皮细胞通常会发生细胞凋亡。

14.可选步骤： 如果在收集前用染料对细胞进行预处理，则可在使用细胞渗透性染料形成管网后的孵育期结束时对细胞进行染色（例如，钙黄绿素、AM）          

• 向细胞中加入染料，并在 37°C 和 5% CO₂（避光）下孵育 30 分钟。最终染料浓度应为 2 µg/mL。
• 使用移液器轻轻地取出含染料的培养基，然后用等体积的预热培养基 200 PRF 更换。替换培养基与血管生成过程中孵育细胞的培养基应完全相同。

15. 如果使用荧光染料，则细胞可使用荧光显微镜观察。 如果不使用荧光染料，则细胞可使用光学显微镜直接观察。

 图 1. 诱导内皮细胞重组为 3D 血管结构。使用 LSGS 补充培养基 200PRF，将人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)（42,000 个活细胞/cm2）接种到包被有 Geltrex 基质（50 μL/cm2）的 24 孔聚苯乙烯板上，并在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育。在接种后 16 小时，将 2 μg/mL 的 Invitrogen (A) 钙黄绿素，AM（货号 C3099），(B) 钙黄绿素蓝，AM（货号 C1429）或 (C) CellTrace 钙黄绿素红-橙，AM（货号 C34851）直接加入培养孔中，在 4x 放大倍数下成像前孵育 20 分钟 (37°C, 5% CO2)。(D) 代表性相位对比图像

图 2. 内皮血管形成测定的低背景。使用未补充添加剂的培养基 200PRF，将人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)（42,000 个活细胞/cm2）接种到包被有 Geltrex 基质（50 μL/cm2）的 24 孔聚苯乙烯板上，并在 37°C 和 5% CO2 条件下孵育。在接种后 16 小时，将 2 μg/mL 的 (A) 钙黄绿素，AM（货号 C3099），(B) 钙黄绿素蓝，AM（货号 C1429）或 (C) CellTrace 钙黄绿素红-橙，AM（货号 C34851）直接加入培养孔中，在 4x 放大倍数下成像前孵育 20 分钟 (37°C, 5% CO2)。(D) 代表性相位对比图像。

1. Davis G, Senger D. (2005).Endothelial extracellular matrix: biosynthesis, remodeling, and functions during vascular morphogenesis and neovessel stabilization. Circ Res. 97(11):1093-1107.
2. Donovan D et al. (2001) Comparison of three in vitro human 'angiogenesis' assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4(2):113-121.

LT167     更新于  2011 年 10 月 6 日