细胞计数、活性、增殖、冻存及细胞凋亡支持 - 入门

The procedure given below is a sample protocol for establishing cultures from the contents of one vial. 

1. Prepare a beaker of water at 37 degrees C.
2. Remove a vial of cells from liquid nitrogen storage, taking care to protect hands and eyes. 
3. Loosen the cap on the vial 1/4 turn for 10 seconds to release any liquid nitrogen that may be trapped in the threads, then re-tighten the cap. 
4. Dip the lower half of the vial into the 37 degrees C water to thaw. 
5. When the contents of the vial have thawed, wipe the outside of the vial with disinfecting solution and move to a Class II, type A laminar flow culture hood. 
6. Open the vial and pipette the suspension up and down with a 1 mL pipette to disperse the cells. 
7. Remove 20 mL from the vial and dilute the cell suspension in 20 mL of trypan blue solution (for example: Gibco Trypan Blue, Cat. No. 15250-061). 
8. Use a hemacytometer to determine the number of viable cells per mL. 
9. Dilute the contents of the vial (1 mL) to the concentration recommended by the product instructions (for example 1.25 X 10E4 viable cells/mL for Gibco neonatal human epidermal keratinocytes ). 
10. Add 5 mL of cell suspension to each 25 cm² culture flask or 15 mL of cell suspension to each 75 cm² culture flask. 
11. Following inoculation, swirl the medium in the flasks to distribute the cells. Many cell types attach to culture surfaces quickly, and if the medium is not distributed immediately following inoculation, the cells may grow in uneven patterns. 
12. Incubate the cultures in a 37 degrees C, 5% CO²/95% air, humidified cell culture incubator. For best results, do not disturb the culture for at least 24 hours after the culture has been initiated.

There isn’t a Drug Master File, but there is a Device Master File on file with the FDA. Please contact our Licensing team at outlicensing@thermofisher.com in order to obtain instructions for referencing this Device Master File.

Synth-a-Freeze™冻存培养基适用于任何标准冷冻方案。其性能可媲美我们标准含有血清的冻存培养基，适合低温储存各种类型的细胞，例如人类角质细胞、胚胎干细胞、神经干细胞和间充质干细胞等。

没有，但是有FDA备案的设备管理档案。请通过outlicensing@lifetech.com联系我们的许可证团队获取设备管理档案备案说明。

我们推荐使用含10% FBS和10% DMSO的DMEM，或者Recovery™细胞培养冷冻培养基。您可以尝试常规冷冻细胞的操作流程，仅更换冷冻溶液。

目前还没有任何实验数据。最好小份分装这种产品。

Recovery™细胞冻存培养基在2到8°C条件下应该可以稳定存放一周，但我们并没有数据支持此结论。

一般细胞培养的各种生长培养基都可以与Recovery™细胞冻存培养基兼容。尽管有其他方案可以替代（这也需要最后用户决定），我们推荐您在接种前移除Recovery™ 细胞培养冷冻培养基。

台盼蓝是一种在活性群体中评估死细胞数量的细胞非通透性的染料。其主要应用原理是，它属于一种带电荷的染料，除非细胞膜损伤，否者无法进入细胞内。活（活性）细胞排斥该染料，但是死（无活性）细胞或者细胞膜损伤的细胞会染上蓝色。

台盼蓝会结合到血清蛋白和细胞蛋白，这会导致高的背景染色。如果背景太暗，计数前细胞应离心下来并在非蛋白培养基、缓冲液或普通生理盐水中重悬。

我们推荐向1 mL细胞加入0.1 mL台盼蓝储液（终浓度为0.04% w/v）。根据样品和仪器，终浓度范围从0.04%到0.2%（w/v）。

有，您可以通过此链接找到方案。

台盼蓝会染色细胞膜损伤的细胞，不能区分凋亡或坏死引起的细胞膜损伤。

这取决于细胞使用的荧光染色的类型。台盼蓝是一个细胞膜非通透性的染料且可以淬灭荧光。其可以淬灭活细胞表面的荧光染色或死细胞内部荧光染色。

alamarBlue™细胞活性试剂是一个可靠的细胞活性和增殖的指示剂，包含有效成分刃天青，一种无毒、细胞通透型不带荧光的蓝色指示染料。健康的细胞在其细胞质中具有还原活力。alamarBlue扩散进入细胞后，活细胞中潜在的天然还原力将刃天青转变成亮红色的细胞膜通透型荧光染料试卤灵。刃天青通过脱氧被还原。

活细胞连续不断地将刃天青转变为试卤灵，从而对活性、增殖、细胞毒性进行数量测定。净结果是可以测量的颜色和荧光强度的变化。荧光或吸光值与活细胞的数量成正比，反映了细胞代谢活性。相比于健康的细胞，损伤和死亡的细胞代谢活性低因此产生强度信号相对较低。

尽管大部分文献报道alamarBlue™试剂中的活性成分刃天青对细胞无毒，但其他报道表明细胞活力会受到影响，且取决于刃天青孵育的时间和孵育浓度。

alamarBlue™试剂适用于多种不同种类细胞：哺乳类动物、鸟类、两栖类动物、鱼类、硅藻属、细菌、植物细胞、真菌等，以及其他细胞样品，例如无限增殖培养细胞、原代培养细胞、癌细胞、干细胞等。同时，该试剂还可用于测定组织样品活性，例如心脏瓣膜和AlgiMatrix™ 3D矩阵中培养的细胞。这类应用有许多参考文献。您可以通过搜索alamarBlue™和您的目的细胞类型来找到它们。例如，使用谷歌学术，使用搜索项 ‘alamarBlue and cancer cells’或‘alamarBlue and tissue’。

alamarBlue™细胞活性试剂对光敏感，需要避光储存。产品可以在室温下储存12个月。保质期见产品标签。如果要储存超过12个月，在2-8°C条件下储存可将储存时间增加至20个月。alamarBlue™试剂可以在低于–70°C条件下长久储存。因为此指示剂是一个多组分溶液，我们建议冷冻的alamarBlue™试剂加热至37°C，摇匀确保所有的组分完全溶解。

• 荧光：使用530–570 nm（激发峰为570 nm）间的激发波长进行荧光读数。使用580–610 nm（发射峰为585 nm）间的发射波长进行荧光读数。
• 吸光度：在570 nm处读取alamarBlue™试剂的吸光值，使用600 nm作为参考波长（以600 nm的值进行归一化）。

注：荧光检测更加敏感。当无法使用荧光仪时，可以测量alamarBlue™试剂的吸光值。对于大多数动物细胞样本，实验平板或试管可以用锡箔纸或塑料薄膜包裹（防止蒸发），4°C贮存，1-3天内读值不会影响荧光或吸光值。这可能不适用于细菌、藻类、原生动物或真菌样品。

我们建议设置合适的实验对照。为了最小化实验误差，我们推荐对实验和无细胞对照设置最少4到8个重复，从而测量数值。一些建议如下：

• 无细胞对照：只有培养基的孔可用于测定背景荧光值，并可从实验组孔数值中将其减去。我们建议在对照组中采用相同浓度的血清。酚红可能会干扰实验：理论上实验应该在不含酚红的培养基中进行。
• 无细胞+实验化合物对照：仅含培养基并添加化合物来评估实验中使用药品/化合物导致的潜在的背景荧光或吸光度。
• 未经处理细胞对照：如果您用化合物处理细胞，我们建议您设置未处理细胞的孔。
• 溶剂对照：如果您用有机溶剂例如DMSO、乙醇等溶解的化合物处理细胞，我们推荐您设置仅添加了有机溶剂和细胞的孔（与添加到实验样品中的体积相同，无化合物）：这个对照得到的结果应该与未处理细胞对照相似。如果这些样品得到的结果与未处理的对照不同，此样品可能对溶剂敏感。

您可能需要根据每种类型细胞决定alamarBlue™实验铺板密度和孵育时间，使用可以使实验处于线性范围内的条件。

铺板密度：

当细胞处于指数生长期时，alamarBlue™试剂测定的细胞增殖最准确。一旦细胞密度太高，细胞增殖就会减少，alamarBlue™试剂的还原低于期望值。低细胞密度时，低的生长速率会导致alamarBlue™的还原不显著。通常建议处于对数生长期的动物细胞密度为1 x 10E4细胞/mL。然而，由于细胞增殖速率不同，不可能为所有的实验推荐一个细胞密度。取而代之的，我们建议进行一个对照实验来确定您实验的最佳细胞密度。产品手册中提供了详细的方案。

孵育时间：

优化alamarBlue™试剂孵育时间同样重要。将细胞在alamarBlue™试剂中37°C或者在种群/细胞类型最佳的温度条件下培养1-4小时。为了更加灵敏地检测低密度细胞数量，增加孵育时间到24小时。如果您计划使用长的孵育时间（过夜），在添加试剂和接种时确保维持无菌条件避免微生物污染物。由于微生物污染物同样会还原alamarBlue™试剂，污染的培养基会产生错误的结果。产品手册中提供了详细的方案。

alamarBlue™试剂包含了专有的缓冲液试剂，可以维持溶液中氧化或还原形式的alamarBlue™试剂和其他组分的稳定性和可溶性。过长时间孵育细胞，缓冲液能力会变低，试剂的稳定性和可溶性都会受到影响，导致信号丢失。

另外，如果实验的长度长于alamarBlue™最佳的培养时间，我们建议使用终点法检测。这种类型的实验对于超过几天、几周和几个月的细胞增殖研究特别有用。alamarBlue™试剂能用于长期的反复测定的细胞增殖研究。对于此类研究，在终点法检测之前，我们建议每个时间点取得小份的细胞培养基/悬浮液加入alamarBlue™试剂进行孵育。

胎牛血清（FBS）和牛血清蛋白（BSA）会引起一些荧光淬灭。我们建议在对照组中使用同样浓度血清来体现这种淬灭。假定培养基不含还原剂，其他培养基组分不干扰实验。如果生长培养基的pH没有显著变化，则其中的酚红基本不存在干扰。在中性pH或其附近，酚红的存在仅仅会提高大约0.03单位的值。理论上，实验应该在没有酚红的培养基中进行。

我们的alamarBlue™试剂含有的刃天青包含在一种专有的稳定配方并提供了一种方便的“混合、孵育和读值”的方案。C12-刃天青是刃天青的衍生物，由于含有十二碳烷基链，其拥有良好的细胞滞留性，因此适用于伴有活性指示剂和其他生物标记的流式细胞分析仪多重检测分析。

PrestoBlue™细胞活性试剂是一个可靠的细胞活性和增值的指示剂。其包含有效成分——刃天青，一种无毒的，细胞膜透过型不带荧光的蓝色指示染料。健康的细胞在其细胞质中维持还原活力。PrestoBlue扩散进入细胞后，活细胞中潜在的天然还原力将刃天青转变成明亮红色的，细胞膜通透型荧光染料试卤灵。刃天青通过脱氧被还原。

活细胞连续不断的将刃天青转变为试卤灵，可以对细胞活性、增殖、细胞毒性进行数量测定。净结果就是测得的颜色和荧光强度的变化。荧光或吸光度的量与活细胞数量成正比，反应了细胞代谢活性。相比于健康的细胞，受伤和无法存活的细胞代谢活性很低且因此产生强度信号相对较低。

大部分文献报道PrestoBlue™试剂中的活性成分含有的刃天青对细胞无毒，其他报道则明确表明对细胞活性的影响取决于刃天青孵育时间长短和刃天青的浓度。以我们的经验，如果实验条件一直保持在推荐的培养周期（例如；10分钟-2小时），在PrestoBlue™试剂中的细胞不太可能受到其负面的影响。PrestoBlue™试剂存在的情况下，细胞能够培养长达24小时，可再进一步培养。只要从细胞中移除试剂并以生长培养基取而代之。

PrestoBlue™细胞活性试剂足够灵敏到可以在384孔板的单孔中检测10个动物细胞。

将从0-100,000连续两倍稀释的Jurkat细胞与PrestoBlue™试剂一起在37°C/5% CO2条件下培养10分钟到16小时。对于10分钟培养，98细胞的信号比无细胞对照±3标准差的要高很多（A）。对于16小时培养，12细胞的信号比无细胞对照±3标准差的要高很多（B）。

不需要。它以10x即用的形式提供，能直接添加到细胞培养基中。每90 μL样品添加10 μL的试剂即可。

刃天青和试卤灵都对光敏感。延长PrestoBlue™试剂光照下的曝光时间（超过1个月）会增加背景荧光且减少实验的灵敏度，建议在棕色玻璃瓶中保存。可以通过设置无细胞对照组来校正背景荧光，但是实验的窗口值会减小。

冷冻之后您依旧可以使用PrestoBlue™试剂。经过5次冻融PrestoBlue™试剂我们测试发现其实验性能并无太多改变。使用前请务必确保试剂完全混匀。

将PrestoBlue™试剂在室温下过夜不会有任何问题。PrestoBlue™试剂可以在室温下（~22°C）避光稳定保存至少3个月。

PrestoBlue™试剂可用于活细胞或终点实验。使用该试剂，您可以在不使用危险试剂或不需要处理闪烁混合液和放射性废物的条件下，进行活细胞实验实时监测细胞代谢和活性。实验过的细胞能够继续培养或用于进一步的后续实验。另外，对大多数动物细胞而言，实验平板或试管能用锡箔纸包裹，储存在4°C条件下，且在1-3天内读数不影响荧光值和吸光度。这可能不适用于细菌、藻类、原生动物或真菌样品。

如果进行终点实验，可以通过添加3% SDS（每100 μL原始培养体积加入50 μL的3% SDS 是足够的）来终止和稳定反应。倘若避光和封闭保存防止蒸发，在记录数据前，平板可以储存在室温下长达48小时。经过这一步骤后，细胞不能进一步培养。

PrestoBlue™试剂适用于多种不同种类细胞：哺乳类动物、鸟类、两栖类动物、鱼类、硅藻属、细菌、植物细胞、真菌及其他——也包括细胞样品，例如无限增值细胞培养、癌症细胞、干细胞、初代细胞培养和悬浮细胞培养。同时，PrestoBlue™试剂可用于测定组织样品活性，例如心脏瓣膜和在AlgiMatrix™矩阵的3D矩阵中培养的细胞。这类应用有许多参考文献。您可以通过搜索PrestoBlue™和您的目的细胞类型来找到它们。例如，使用谷歌学术，使用搜索项‘alamarBlue and cancer cells’ 或 ‘alamarBlue and tissue’。

我们推荐从最少4-8组重复实验和无细胞对照样品中获得数值，一些建议如下。

• 无细胞对照：只有培养基的孔可用于测定背景荧光值，并可从实验孔数值中将其减去。我们建议在对照组中采用相同浓度的血清。酚红可能会干扰实验：理论上实验应该在不含酚红的培养基中进行。
• 无细胞+实验化合物对照：仅含培养基并添加化合物来评估实验中使用药品/化合物导致的潜在的背景荧光或吸光度。
• 有机溶剂对照：如果您用有机溶剂例如DMSO、乙醇等溶解的化合物处理细胞，我们推荐您设置仅添加了有机溶剂和细胞的孔（与添加到实验样品中的体积相同，无化合物）：这个对照得到的结果应该与未处理细胞对照相似。如果这些样品得到的结果与未处理的对照不同，此样品可能对溶剂敏感。

您可能需要根据每种类型细胞和使用条件来决定PrestoBlue™实验铺板的密度和孵育时间，以使实验处于线性范围内。

铺板密度：

当细胞处于指数生长期时，PrestoBlue™试剂测定的细胞增殖最准确。如果细胞密度太高，细胞增殖将会减少，PrestoBlue™试剂的还原少于期望。低细胞密度时，低的生长速率会导致PrestoBlue™的还原不显著。通常建议对数生长期的动物细胞密度为1 x 10E4细胞/mL。然而，由于细胞增殖速率不同，不可能为所有的实验推荐一个细胞密度。取而代之的，我们建议进行一个对照实验来测定您实验的最佳细胞密度。产品手册中提供了详细的方案。

孵育时间：

优化PrestoBlue™试剂孵育时间同样重要。将细胞在PrestoBlue™试剂中37°C或者在种群/细胞类型最佳的温度条件下培养1-4小时。为了更加灵敏地检测低密度细胞数量，增加孵育时间到24小时。如果您计划使用长的孵育时间（过夜），在添加试剂和培养时确保维持无菌条件降低引入微生物污染物。由于微生物污染物同样会还原PrestoBlue™试剂，污染的培养基会产生错误的结果。产品手册中提供了详细的方案。

PrestoBlue™试剂包含了专有的缓冲液试剂，可以维持溶液中氧化或还原形式的PrestoBlue™试剂和其他组分的稳定性和可溶性。过度延长细胞的培养时间，缓冲液能力会变为很低，试剂的稳定性和可溶性都会受到影响，导致信号丢失。

另外，如果实验长于PrestoBlue™最佳的培养时间，我们建议使用终点检测法。这种类型的实验对于超过几天、几周和几个月的细胞增殖研究特别有用。PrestoBlue™试剂能用于长期的反复测定的细胞增殖研究。对于此类研究，在终点法检测之前，我们建议每个时间点取得小份的细胞培养基/悬浮液加入PrestoBlue™试剂进行孵育。

如果您测试的化合物有毒性延迟现象（例如细胞几小时或几天后才会表现出反应），我们建议在细胞已经被影响之后的预定孵育末期添加PrestoBlue™试剂。如果PrestoBlue™试剂添加于实验开始阶段，在药物起作用之前，活性细胞将会还原刃天青，因此影响您最终的结果。

如果使用单通道移液枪在96或384孔板上多重孔上加样，为了结果一致，在移动到下一个条件前，给所有条件相同的孔添加PrestoBlue™试剂。当板上最后一个孔试剂添加完成后开始计时。

• 荧光：使用530–570 nm（激发峰为570 nm）的激发波长进行荧光读数。使用580–610 nm（发射峰为585 nm）的发射波长进行荧光读数。
• 吸光度：在570 nm处监测PrestoBlue™试剂的吸光度，使用600 nm作为参考波长（以600 nm的值进行归一化）

注：荧光检测更加敏感。当荧光仪器无法使用时，可监测PrestoBlue™试剂的吸光度。对大多数动物细胞样本，实验平板或试管可以用锡箔纸或塑料薄膜包裹（防止蒸发），贮存在4°C下，1-3天内读数不会影响荧光或吸光值。这可能不适用于细菌、藻类、原生动物或真菌样品。

胎牛血清（FBS）和牛血清蛋白（BSA）会引起一些荧光淬灭。我们建议在对照组中使用同样浓度血清来体现这种淬灭。假定培养基不含还原剂，其他培养基组分不干扰实验。如果pH没有显著变化，没有来自生长培养基中酚红的干扰。在中性pH或其附近，存在的酚红仅仅会提高大约0.03单位的值。理论上，实验应该在没有酚红的培养基中进行。

• 用于流式细胞仪分析的LIVE/DEAD™可固定试剂盒适用于固定。这些试剂盒使用胺基反应细胞-非渗透染料对活细胞细胞表面和死细胞胞质染色——活细胞暗淡死细胞明亮。因为染料共价结合到细胞，固定后保留。不幸的是，此方法对基于成像的实验效果不好，由于所有细胞都被染色，很难通过显微镜从暗淡的活细胞中分辨出明亮的死细胞。
• 用于成像和高通量扫描（HCS）分析的Image-IT™ DEAD绿色活性染料（货号I10291）是一种活细胞非透过型DNA结合染料，固定且透过后可保留长达48小时。
• 我们同时推出用于成像分析的LIVE/DEAD™ Reduced Biohazard Cell Viability试剂盒（货号L7013），其含有两种DNA结合染料，SYTO™ 10和Dead Red，可以有效染色且通过4%戊二醛固定后快速分析。

注：总的来说，DNA结合的染料和钙黄绿素AM不适用于固定，由于这些染料不能共价地结合到细胞组分上，因此会在固定后缓慢扩散出细胞，逐渐地将所有细胞都染色。

不可以，不可能测试相同群体细胞的活性超过几小时；您可以使用重复的样品。DNA结合的染料对细胞有毒；染色后细胞应尽快成像。钙黄绿素AM不能停留在细胞中，根据不同类型的细胞，在几分钟到若干小时内，其可能会被细胞主动地排出。钙黄绿素AM对细胞无毒，因此其可以重复添加到相同的样品中。您可以使用alamarBlue™试剂或PrestoBlue™试剂进行相同样品超过若干天的细胞增殖检测，因为这些染料对细胞是无毒性的。

有两种简单的方法。一种是通过60°C放置20分钟热灭活细胞。第二种是将细胞放入70%乙醇。乙醇固定的细胞可以在冰箱中无限期储存直到使用，可达好几年。

1. 离心细胞、使细胞沉淀并去除上清
2. 固定细胞：在15mL含有细胞团的试管中加入10 mL70%冰乙醇，先开始逐滴加入后震荡，混合均匀。
3. 在冰箱中储存直到使用。
4. 快使用时，水洗两次且在选择的缓冲液中重悬。

我们已经确认可在Countess™ II FL全自动细胞计数仪上使用下列试剂盒：

• LIVE/DEAD™ Viabilty/Cytoxicity试剂盒（货号L3224）含有钙黄绿素AM和溴乙啡锭二聚体
• ReadyProbes™ Cell Viability Imaging试剂盒，蓝/绿（货号R37609）
• ReadyProbes™ Cell Viability Imaging试剂盒，蓝/红（货号R37610）含有NucBlue Live/NucGreen Dead和NucBlue Live/propidium iodide

见此应用说明中的详情。

关于可用于活性测定产品的例子见本文的表1，根据现有的激发光源和发射光颜色，可用于线粒体细胞膜电位、代谢和酶活性、钙流、pH改变和细胞分裂实验。

已被验证过的alamarBlue™ 细胞活性试剂，PrestoBlue™细胞活性试剂, 和CyQUANT™ 细胞增殖实验试剂盒（货号C7026）可用于AlgiMatrix™ 3D培养体系，同时也可以与其他3D培养体系一同使用。更多细节，请参考这个海报和手册。

alamarBlue™试剂和PrestoBlue™试剂含有的刃天青包含在一种专有的稳定配方中，能够提供了一种便捷的“混合、接种和读数”实验方案。PrestoBlue™试剂是alamarBlue™试剂的改进配方允许更快速的染色（典型的10分钟相比于1-4小时获得相似的信号和灵敏度）。C12-刃天青是刃天青的衍生物，其拥有良好的细胞滞留性，因此适用于伴有活性指示剂和其他生物标记的流式细胞分析仪多重检测分析。

可以在同种样品中将PrestoBlue™试剂（用于细胞增殖）和CellEvent™ Caspase 3/7 Green 检测试剂（用于细胞凋亡检测）结合

 CHO-K1细胞培养在含有无酚红完全培养基的384-孔板中，5,000细胞/孔，每孔中含有经过一系列稀释的十字孢碱。平板在37° C/5% CO2中培养了19个小时。PrestoBlue™试剂和CellEvent™试剂直接添加到孔中，平板在荧光读数前37°C/5% CO2条件下培养30分钟。在Tecan Safire2孔扳读数仪（底读）上检测荧光信号，CellEvent™试剂设定为Ex 500 nm /Em 530 nm，带宽7 nm，PrestoBlue™试剂设定为Ex 560 nm/Em 590 nm，带宽10 nm。

CellTrace™细胞增殖试剂是一种细胞透过型染料，胞内酯酶可将其分解产生高荧光化合物并可以共价地结合到细胞内的胺类上，将染料附着于多种细胞内组分并产生稳定的信号。这些试剂毒性很小并对多种细胞增殖活性的影响很小。

我们提供小份的CellTrace™试剂并强烈建议丢弃任何未用的DMSO染料储备液。CellTrace™试剂有二醋酸基团可以封闭染料的电荷，使得它们可以透过细胞并且琥珀酰亚胺酯胺反应基团可允许长时间滞留。如果储存环境中含有水，二醋酸盐和琥珀酰亚胺酯都易于水解。DMSO是吸水性的因此极易从大气中吸收水。如果您必须要储存您的染料储备液，您需要使用高质量的无水DMSO储备液，不能经常打开且将小瓶密封放置于密封的含有干燥剂的地方来保持DMSO/染料储备液尽可能的干燥。-20°C保存。在短时间内尽快使用。

无论是流式、成像或者微孔板实验，如果您使用EdU或EU，最简单的方法就是购买一个专门用于您实验类型的完整试剂盒。完整的试剂盒包括叠氮化物检测试剂和铜离子以及进行连接反应必须的缓冲液。如果您有一个不同的炔烃代谢类似物或不想购买EdU或EU，那您需要购买我们任何一个叠氮化物染料检测试剂和Click-iT™反应缓冲液试剂盒（货号C10269），其含有铜离子溶液，进行流式与成像实验连接反应必须的缓冲液试剂。如果您希望进行微孔板实验，然而您只能进行Click-iT™ EdU微孔板实验（货号C10214），其为连接反应和进行信号放大提供了所有必须的试剂，因此可以在微孔板读数仪上检测到。

很遗憾，Click-iT™实验试剂盒中使用的叠氮化物染料的确切浓度是专利保护的，因此我们不能提供其确切的使用浓度。对于一般的指导准则，我们建议配制1-10 mM DMSO储备液，连接反应的终浓度约为1–10 μM。染料浓度过高会导致高非特异性背景或者染料聚集；浓度太低会导致信号强度不够。

Click-iT™试剂盒中提供的硫酸铜溶液组件是溶于水的100 mM硫酸铜。硫酸铜（CuSO4）粉末可以从多个化学供应商处购买。

Click-iT™ Plus实验使用了一个修饰的甲基吡啶叠氮化物染料且降低铜离子浓度并加入了特别的铜离子保护剂，其将铜离子置于嵌入的炔烃基团位置因而降低了铜对生物分子的损伤。初代Click-iT™试剂盒使用非修饰叠氮化物染料和高铜离子浓度来进行连接反应，这可能抑制酶的活性，包括HRP和会淬灭GFP、RFP、mCherry及其他荧光蛋白的荧光，也包括R-藻红蛋白。如果您不希望修改您的抗体染色方案或拥有荧光蛋白表达细胞，就使用Click-iT™ Plus试剂盒。

不可以，Click-iT™ Plus和初代Click-iT™试剂盒中的用于连接反应的试剂和检测试剂不可以混用。Click-iT™ Plus实验使用修饰的甲基吡啶叠氮化物染料且降低铜离子浓度并加入了特别的铜离子保护剂，其将铜离子置于嵌入的炔烃基团，然而初代Click-iT™试剂盒使用非修饰叠氮化物染料和高铜离子浓度来进行连接反应。

Click-iT™ EdU流式试剂盒使用浓度更低的叠氮化物染料，相比之下EdU成像试剂盒对其进行了优化，因此不可能为成像实验使用流式试剂盒标记细胞。可以在流式分析的样品中使用Click-iT™ EdU成像试剂盒，但是必须先优化叠氮化物染料浓度。Click-iT™ EdU试剂盒中使用的叠氮化物染料的浓度是专利保护的。

有的，在透化作用步骤前，您可以将甲醛固定和清洗后的样品储存起来。就将细胞保存在PBS中，将容器良好的封闭并密封，4°C储存。细胞应该至少1星期完好。您也可以在连接反应和清洗步骤后将样品储存起来，在第二天进行免疫染色和核染色。

有的，经过注射或培养基孵育后可以获得适当的EdU嵌入。根据嵌入方法和器官/组织类型，优化EdU培养时间和浓度。可以在EdU（5-乙炔基2’-脱氧尿苷）的产品手册的表2中找到推荐方案。

EdU频繁用于体内实验，因此可以在文献和产品页找到多种案列。为您的样本使用优化的BrdU标记方案将会是一个好的开端。

组织样品可以冷冻或石蜡包埋，之后用正常的处理过程进行后续的IHC染色。对于EdU检测，使用合适的固定和透化方法，之后根据产品手册上细胞培养的方案进行连接检测反应。

我们还没有验证在3D培养体系中使用EdU研究增殖，但是这种试剂适用于体内细胞标记，其同时可预料能够标记3D培养体系中的细胞。文献中有大量关于在3D培养体系中使用这种产品报道；此处有一些引证：

Lei Y, Schaffer DV (2013) A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 110:E5039–E5048.

Derda R, Laromaine A, Mammoto A et al. (2009) Paper-supported 3D cell culture for tissue-based bioassays. Proc Natl Acad Sci U S A 106:18457–18462.

Robertson FM, Ogasawara MA, Ye Z et al. (2010) Imaging and Analysis of 3D Tumor Spheroids Enriched for a Cancer Stem Cell Phenotype. J Biomol Screen 15:820–829.

可以，EdU和BrdU标记能结合起来在培养细胞和体内用于细胞增殖的双重标记。BrdU将会优先的嵌入到DNA，因此先进行EdU培养再进行BrdU培养。当添加BrdU作为第二标记时，不需要从细胞培养的培养基中移除EdU。进行乙醇固定，随后进行BrdU检测方案中需要的DNA变性的一些方法。之后为EdU检测进行连接标记反应，随后进行用于BrdU检测的抗体标记。确保选择一个不和EdU交叉反应的BrdU抗体，例如我们的MoBU-1克隆（货号B35141）。许多BrdU抗体表现出对EdU一定程度的交叉性反应。此处是使用EdU和BrdU进行双-脉冲标记案例的链接。

也许可以，但是如果您没有在第一次Click反应中将所有的代谢嵌入EdU完全标记，之后其可能在第二次的TUNEL标记Click反应中被标记，导致细胞凋亡假阳性。将Click-iT™ EdU 标记与BrdU TUNEL 标记结合会更简单，因为BrdU检测不会与EdU标记的细胞交叉反应。如果您真的希望为增殖和细胞凋亡检测进行双EdU标记，您必须使用新鲜的连接试剂来重复连接反应检测代谢嵌入的EdU，确保进行EdU TUNEL实验前所有的嵌入EdU已经被标记。之后您应该进行一个无–TdT酶EdU TUNEL对照实验来验证TUNEL连接反应没有信号产生。

不可以，EdU代谢标记试剂必须用于活细胞，但是实际的检测反应必须在固定和通透的样品上进行，因为叠氮化物检测试剂和缓冲液组分是细胞非透过型。

膜联蛋白V染色分析最好在是活细胞上进行。如果您需要固定您的细胞并用于分析，用3.7%甲醛在含有钙和镁的PBS溶液中固定可以维持连接。透化作用后信号不会保留，因此膜联蛋白V染色无法与内部抗体标记兼容。

先用胰蛋白酶消化，用膜联蛋白V偶联染料染色之前，在合适的细胞培养条件和培养基中复苏约30分钟。用胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞暂时打乱了质膜，使得膜联蛋白V连接到细胞膜的胞内面上的磷脂酰丝氨酸，因此导致假阳性染色。对于轻微粘连细胞系例如HeLa和NIH 3T3，您可以使用低强度（无酶）的解离产品如Gibco™ Cell Dissociation Buffer（货号13151014）

膜联蛋白V染色一般不用于成像实验；而是流式细胞仪分析的最佳试剂。所有的细胞染色程度都会相近，因此很难从暗的非凋亡细胞中分辨出相对明亮的膜联蛋白V染色的细胞。使用我们的CellEvent™ Caspase 3/7 或Image-iT™ LIVE Caspase检测试剂盒检测caspase酶活化，这是用于成像实验最佳的方法。

可以，在3.7%甲醛中固定15分钟后，CellEvent™信号将会保留。

CellEvent™ Caspase 3/7是唯一的可用于活细胞中检测细胞凋亡的试剂且不需要水洗。该试剂对细胞无毒且在半胱天冬蛋白酶激活后结合到DNA上才会发荧光。

您应该设置凋亡细胞对照和死亡细胞对照。常用于产生细胞凋亡的试剂是十字孢碱，喜树碱和缬氨霉素。其他处理产生凋亡细胞的一般药品列于下表。并不是每个试剂都会在每种类型的细胞中诱导细胞凋亡，需要优化使用的浓度和接种孵育时间。根据选择的试剂和使用的浓度，特异蛋白诱导的最高产量出现在处理后的8–72小时的任何时间内。

有两种简单的选择可以设置死细胞对照。一种是通过60°C加热 20分钟热灭活细胞。第二种是将细胞放入70%乙醇。乙醇固定的细胞可以在冰箱中无限期储存直到使用，理论上可达好几年。

1. 离心细胞、使细胞成团并去除上清
2. 固定细胞：在15mL含有细胞小球的试管中加入10 mL70%冰乙醇，先开始逐滴加入并震荡，混合均匀。
3. 在冰箱中储存直到使用。
4. 快使用时，水洗两次且在挑选的缓冲液中重悬。

我们已经证实CellEvent™ Caspase 3/7 Green Detection Reagent（货号C10423）结合 SYTOX™ Red Dead Cell Stain （货号S34859）可用于Countess™ II FL全自动细胞计数仪上从死亡细胞中鉴别凋亡细胞。更多详情，请见应用说明。

见本文的表1，在0-4小时的期间，用10 µM喜树碱诱导Jurkat细胞。值得注意的是，这些结果是通过使用单细胞类型和诱导体系研究得到的；对于其他实验体系结果可能不同。凋亡细胞的细胞膜通透性增加，使用YO-PRO™-1染料结合碘化丙啶或SYTOX™死细胞指示剂能将其与死细胞区分开。其他中期凋亡事件是细胞ROS产物增多（用CellROX™ reagents，H2DCFDA试剂检测），细胞的pH变化（BCECF, SNARF™-1）和钙离子释放（Fluo-4, Fura-2, Indo-1）。任何条件下，没有单个参数能够定义凋亡，因此研究凋亡时最好采用多种参数的方法

初代Click-iT™ TUNEL实验试剂盒针对细胞培养样品优化，也可用于组织样品。我们建议对组织样品使用Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection实验试剂盒；用于组织的Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection实验试剂盒的实验方案针对组织样本优化。通过改进方案可以提高TdT酶进入多层细胞组织样品的效果。另外，相比于Click-iT™ Plus TUNEL试剂盒，我们发现初代Click-iT™ TUNEL试剂盒可能会在组织样品出现高度非特异性结合和点状染色。有一个增加组织透过性较好的方法是用蛋白酶K消化然后甲醛中再固定样品以取代去污剂透化作用步骤。Click-iT™ Plus TUNEL试剂盒手册第三部分的组织固定和透化作用方案可用于初代Click-iT™ TUNEL实验处理组织样品。胃蛋白酶和其他的蛋白水解酶同时也可用于提高组织透过性。

我们在5–20 µM 厚度的老鼠肠、肾脏、肝脏、心脏和结肠FFPE切片中验证了Click-iT™ Plus TUNEL for In Situ Apoptosis Detection实验

大部分组织样品需要充分消化15分钟。最佳的培养时间根据组织类型和厚度而不同。我们已经观测到脑组织比其他组织需要更长的蛋白酶处理时间。

我们没有在3D培养体系中使用过EdU TUNEL检测调亡，但是因为这种试剂适用于体内细胞标记，所以它也有希望可以标记3D培养体系中的细胞。文献中有大量关于在3D培养体系中使用这种产品报道；此处有一些引证：

Lei Y, Schaffer DV (2013) A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 110:E5039–E5048.

Derda R, Laromaine A, Mammoto A et al. (2009) Paper-supported 3D cell culture for tissue-based bioassays. Proc Natl Acad Sci U S A 106:18457–18462.

Robertson FM, Ogasawara MA, Ye Z et al. (2010) Imaging and Analysis of 3D Tumor Spheroids Enriched for a Cancer Stem Cell Phenotype. J Biomol Screen 15:820–829.

可以，额外的末端脱氧核苷酸转移酶（rTdT）可以购买。货号为10533-065或10533-075。额外的TdT反应缓冲液可以购买，货号为16314-015。

我们提供Countess™全自动细胞计数仪和 EVOS™细胞成像体系用于细胞计数和活性测定。更多关于这些仪器的信息，请见此处。

初代Countess™全自动细胞计数仪已经停产，但我们依然为此设备提供耗材。初代Countess™全自动细胞计数仪最新的软件和固件依然在此处在页面的底部“初代Countess软件下载”。在购买设备免费赠送的U盘中也提供了该软件。这个软件使您可以处理您的细胞计数数据并且可以将您的数据以PDF的格式保存，可用于打印或归档。

注：作为初代Countess™全自动细胞计数仪一个可替代产品，我们提供Countess™ II和Countess™ II FL全自动细胞计数仪。

更多关于初代Countess™全自动细胞计数仪的信息，请见此处。