表位标签抗体的概述

1984 年，Munro 和 Pelham 首次将抗原决定簇标签作为技术予以说明，其中，已知抗原决定簇采用遗传工程技术融合到一种重组蛋白上（通常位于 N 或 C 端）。融合基因被克隆到适合所需宿主细胞类型和转染的表达载体中。此后，可使用抗原决定簇标签特异性抗体检测或纯化抗原决定簇标签的融合蛋白。

可使用良好表征的标注抗体轻松检测或纯化与抗原决定簇标签融合的已知基因。抗原决定簇标签是研究以下情形的有效方法：

1. 暂没有商用抗体的蛋白
2. 无需生成抗体的全新或新发现的蛋白质
3. 免疫原性较弱的蛋白
4. 内源性条件下的低丰度蛋白
5. 研究蛋白质和蛋白复合物的拓扑结构并识别相关蛋白

抗原决定簇标签以及抗其抗体已证明是一种有效的方法，可在靶蛋白上使用免疫化学和免疫细胞化学方法。抗原决定簇标签抗体可用于各种应用，包括蛋白纯化、蛋白免疫印迹、免疫沉淀、流式细胞分析和免疫荧光。以下是蛋白抗原决定簇标签及其使用标记抗体的检测示意图。

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有多种用于研究目标蛋白的抗原决定簇标签。通常，选择用于基因融合的抗原决定簇标签类型取决于预期的下游应用。下表总结了最常用抗原决定簇标签的特点和应用。

根据抗原决定簇标签特性和应用，将抗原决定簇标签分为三个不同类别：肽标签、亲和标签和荧光标签。继续了解每个抗原决定簇标签类别以及每个可用标签的更多特性。

肽标签是短氨基酸序列，可提供用于检测融合蛋白的独特抗原决定簇。肽标签可串联使用，以提高其检测灵敏度，或者与其他标签结合使用。由于肽标记分子量较小，其通常不会干扰蛋白质功能。它们可以融合到蛋白的 C 端或 N 端，甚至插入蛋白内。常用的肽标签为 HA（来源于流感病毒的血凝素蛋白）、Myc、V5 和 DYKDDDDK。尽管它们最常用于检测，但 DYKDDDDK 等某些肽标签也用于纯化融合蛋白。

以下列出了各种肽标签的简短说明：

血凝素 (HA) 标签
HA 标签来源于人类流感血凝素的表面糖蛋白，与氨基酸 98-106 (YPYDVPDYA) 相对应。由于其在天然血凝素构象中具有高免疫原性和免疫不可及性，因此选择了这一区段。其通常以标签形式与蛋白结合表达，以帮助识别和纯化标记蛋白以进行功能分析。HA 标签抗体可用于帮助标签蛋白的蛋白检测或免疫共沉淀。以下数据显示了用于免疫沉淀 (IP) 和 蛋白免疫印迹 (WB) 检测的 HA 标签单克隆抗体。

c-Myc 标签
c-Myc (Myc) 标签源自 c-myc，这是一种可编码核磷蛋白的原癌基因，在细胞周期进程、凋亡和细胞转化中发挥作用。Myc 标签的长度仅为 10 个氨基酸 (EQKLISEEDL)。其广泛用于蛋白免疫印迹、免疫沉淀和流式细胞术。

V5 标签
V5 抗原决定簇标签源自猴病毒 (SV5) 副黏病毒的 P 和 V 蛋白上的小抗原决定簇 (Pk)。V5 标签通常与所有 14 个氨基酸 (GKPIPNPLLGLDST) 配合使用，但其也与较短的 9 氨基酸序列 (IPNPLLGLD) 一同使用。它可用于检测细菌、酵母、昆虫和哺乳动物系统中重组蛋白的表达。

DYKDDDDK 标签
DYKDDDDK 标签是比较常用的标签。由于 DYKDDDDK 标签比其他常见抗原决定簇标签更亲水，因此极易与融合蛋白相容，并且不太可能让其所附着的蛋白变性或灭活。与其他抗原决定簇标签不同，DYKDDDDK 标签是一种理想的人工设计，其后针对该标签制备了单克隆抗体。通过 DYKDDDDK 标签中的肠激酶切割位点，可以将其从纯化融合蛋白中完全去除。以下数据显示了使用免疫细胞化学技术 (ICC) 检测 DYKDDDDK 标签蛋白。

顾名思义，亲和标签通常用于重组蛋白的亲和纯化。亲和标签从而成为蛋白纯化最有效的工具之一。任何蛋白几乎都可以纯化（与亲和标签融合时），即使事先也不了解其生化特性。首先，目标蛋白在 N 端或 C 端与亲和标记融合。然后，通过与固定化底物的化学或物理相互作用纯化蛋白。用于纯化的亲和色谱类型取决于标签类型。

以下列出了常用于纯化的亲和标签的简短说明：

6X His 标签
6X His 标签是一种由 6 个连续组氨酸残基 (HHHHHH) 组成的合成寡肽。His 标签通常在重组蛋白的 N 或 C 端区域表达为标签。这允许通过固定化金属亲和色谱进行分离或纯化。组氨酸标签通过螯合对 Ni²⁺ 产生的亲和力较强且具有足够的选择性，可以通过 Ni²⁺-NTA 树脂上的亲和色谱进行蛋白纯化。咪唑与组氨酸竞争镍结合，可用于洗脱结合的 His 标签蛋白。His 标签特异性抗体用于帮助标签蛋白的检测或免疫共沉淀。以下数据显示了使用 Ni²⁺-NTA 琼脂糖柱对 His 标签蛋白进行的亲和纯化。

谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) 标签
谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) 是真核生物和原核生物中的 26 kDa 蛋白，在此类生物中，它能够催化多种反应。谷胱甘肽 S 转移酶用于构建 GST 基因融合系统。GST 融合蛋白可通过其对谷胱甘肽的高亲和力从细胞中进行纯化。结合后，使用还原型谷胱甘肽在温和非变性条件下洗脱 GST 融合蛋白，如下图所示。

GST 标签可以放置在 N 端或 C 端，并可增强表达蛋白的溶解度。GST 融合蛋白可为直接蛋白间相互作用进行重要的生物学测定。与其他常见的基于肽的亲和抗原决定簇标签相比，GST 标签相对较大，并且可能会干扰部分蛋白功能。在这些情况下，可以通过蛋白酶切割轻松去除 GST 标签。

麦芽糖结合蛋白 (MBP) 标签
MBP 是一种由大肠杆菌 K12 malE 基因编码的 ~43 kDa 单体蛋白。当与目标蛋白表达为融合蛋白时，MBP 可增加细菌中过表达融合蛋白的溶解度。MBP 融合蛋白可通过其对淀粉样蛋白的高亲和力快速纯化。与直链淀粉树脂结合的 MBP 融合蛋白然后可通过麦芽糖从树脂中洗脱。MBP 标签可使用免疫印迹和免疫沉淀进行检测。MBP 标签可在蛋白的 N 端或 C 端融合，并可使用 3C 蛋白酶轻松切割。

这一类的大多肽序列通常用作融合标签，其中靶蛋白用于其自发荧光。荧光标签用于各种细胞生物学研究，以确定靶蛋白的定位、蛋白动力学和示踪、活细胞成像和细胞分选。使用绿色荧光蛋白 (GFP) 及其家族成员作为荧光标签已成为追踪细胞蛋白的常规工作。荧光标签可以符合读框的方式克隆到靶蛋白，以便其能够在时间和空间内可视化至特定细胞、组织和亚细胞区室。在过去的二十年中，荧光蛋白报告基因的应用已通过改进标签而增强。

以下列出了常用荧光标签的简要说明：

绿色荧光蛋白 (GFP) 标签
维多利亚多管发光水母含有绿色荧光蛋白 (GFP)，可在动物的生物发光反应中发射光。GFP 已广泛用作真核生物和原核生物中基因表达的报告蛋白，以及细胞培养中和多细胞生物中的蛋白标签。GFP 是 27 kDa 的单体蛋白，可自发形成荧光颜料。野生型蛋白可吸收蓝光（峰值 395 nm）并在未添加蛋白、底物或共调节因子的条件下发出绿光（峰值 508 nm）。GFP 荧光稳定且与种属无关，适于多种应用。GFP 作为荧光标签，大量用于监控基因表达和蛋白定位。

红色荧光蛋白 (RFP) 标签
红色荧光蛋白 (RFP) 从海葵香菇珊瑚中分离，是一种在激发时发出红橙色荧光的荧光基团。在 RFP 之前，DsRed 也从 香菇珊瑚中分离。DsRed 的大小和特性与 GFP 相似，但可产生红色而非绿色荧光染料。已经使用定向诱变开发了多种变体。RFP 约为 25.9 kDa。其最大激发波长为 558 nm，最大发射波长为 583 nm。RFP 通常用作分子标签，以研究蛋白定位、报告基因表达和蛋白间相互作用。

mCherry
mCherry 蛋白是来源于 DsRed 的第二代荧光蛋白，这是从香菇珊瑚中分离出的红色荧光蛋白。DsRed 多周期的定向突变和进化选择产生了 mCherry，其最大激发波长为 587 nm，最大发射波长为 610 nm。mCherry 具有抗光漂白的特性，非常稳定，并且成熟度极高。

多年来，生物化学家和细胞生物学家将抗原决定簇标签用于多种应用。一直以来，每个标签的实用功能在不断提高。以下是抗原决定簇标签蛋白的常用应用：

亲和纯化
在基础生物学研究、结构和功能蛋白质组学方面，亲和标签已成为分子生物学、生物化学和细胞生物学研究中应用的强大工具。亲和标签广泛用于促进目标蛋白的纯化和检测以及蛋白复合物的分离。亲和标签包括酶、蛋白结构域或小分子多肽，它们可与一系列高特异性底物结合。底物包括碳水化合物、小生物分子、金属螯合物和抗体，从而可快速高效地纯化蛋白。当添加至目标蛋白时，部分亲和标记可提高重组蛋白的溶解度。6X -His、GST 和 MBP 是通常用于纯化的亲和标签示例为。

用于体外过表达研究的蛋白检测
首先，抗原决定簇标签融合蛋白通过由组成型或诱导型启动子控制的所需质粒构建体克隆，并转染到适当的宿主细胞中进行表达。可以使用蛋白免疫印迹、流式细胞术和免疫荧光等各种技术以及经充分表征的抗原决定簇标签抗体来检测过表达的抗原决定簇标签蛋白。下图显示了过度表达 N 末端 V5 标签 His LacZ 蛋白的蛋白免疫印迹检测。体外过表达研究利用抗原决定簇标签研究靶蛋白及其功能、表达模式和细胞定位。这是表征新型或新发现的蛋白质和低丰度或免疫原性较差蛋白质的有用工具。

免疫沉淀研究
免疫沉淀 (IP) 首先作为传统柱亲和色谱的适配体研究。它是一种基于抗原抗体相互作用原理的技术，用于从生物样品中分离蛋白以研究其特性、表达、翻译后修饰和相互作用配体。通常使用蛋白免疫印迹、质谱法和其他检测分析免疫沉淀样品。在 IP 中，将抗体加入到含有抗原的细胞裂解物或生物样品中进行孵育，以形成抗原抗体复合物。然后，将抗原抗体复合物与蛋白 A/G 包被的磁珠一起孵育，使其能够结合。彻底洗涤磁珠，并使用酸性溶液或 SDS 等去污剂从复合物中洗脱抗原。下图显示了标准免疫沉淀检测的示意图。

IP 有两种可用于研究靶蛋白相互作用的类型。对于与其他蛋白的相互作用，使用免疫共沉淀 (co-IP)。对于与核酸的相互作用，使用染色质免疫沉淀 (ChIP) 或 RNA 免疫沉淀 (RIP)。

当缺乏针对靶蛋白的抗体时，通常使用标签抗体对抗原决定簇标签蛋白进行免疫沉淀。对于 co-IP，在宿主细胞中表达融合至抗原决定簇标签的诱饵蛋白，并使用标记特异性抗体进行免疫沉淀。直接与诱饵蛋白相互作用的蛋白进行共免疫沉淀，然后通过蛋白免疫印迹进行蛋白复合物分析。co-IP 的强大功能大大促进了对蛋白间相互作用网络的了解，这就是人们为何认为 co-IP 是蛋白间相互作用研究的金标准的原因。

同样，ChIP 可用于确定基因组区域，其中抗原决定簇标签的 DNA 结合蛋白关联物使用标签抗体进行免疫沉淀。RIP 与 ChIP 相似，但与抗原决定簇标签的 RNA 结合蛋白而非 DNA 结合蛋白进行免疫沉淀。 

IP 应用中最常用的抗原决定簇标签包括：V5、HA、c-Myc 和 DYKDDDDK。下图显示了使用 DYKDDDDK 标签抗体进行的免疫沉淀。

荧光报告基因可视化
据美国生物学家 Martin Chalfie 于 1994 年在《科学》杂志上发表的文章报道，大肠杆菌和秀丽隐杆线虫存在野生型 GFP 表达。他的研究结果表明，该标志物可以在多种细胞和生物中提供体内荧光。在适当的宿主细胞中表达时，GFP、RFP 和 mCherry 等荧光报告基因蛋白用作含靶基因的融合蛋白，以观察其定位和命运。融合蛋白通过 GFP（或其他报告基因）维持其正常功能以及获得的荧光特性。可通过 GFP 和其他荧光蛋白靶向质膜、高尔基体、细胞核和内质网等所有主要细胞器。

除蛋白定位可视化外，荧光报告基因具有多种应用，详情如下：

• 转录报告基因 – 使用 GFP（或其他荧光蛋白）作为报告基因，在目标启动子的控制下，读取转录活性。GFP 抗体在蛋白免疫印迹检测其表达方面大有益处。
• 活细胞成像 – 跟踪细胞内蛋白的运动，这有助于生物学家了解细胞信号转导并验证各种通路中涉及的蛋白。在这方面，GFP、RFP 和 mCherry 等荧光标签已成为细胞生物学家的便利工具。荧光蛋白抗体提供了追踪活细胞中蛋白质动力学的多种特点。
• 荧光共振能量转移 (FRET) – FRET 用于研究经过构象改变的两种蛋白（与荧光蛋白抗体融合）之间的相互作用。
• 荧光激活细胞分选 (FACS) – FACS 可用于从未表达 GFP 的细胞中分离表达 GFP 的细胞。
• 体内研究或转基因追踪 – 荧光标签是用于监测不同类型细胞和模型系统中基因表达的强大工具。它展示了监测转基因模型系统中基因转移效率的优秀方法。

高级应用：内源性标签
随着基因组后时代新技术的出现，抗原决定簇标签应用的进步也相应扩大。

ChIP-Seq 是 ChIP 的一种形式，通过测序，可用于转录因子 (TF)-DNA 相互作用的全基因组分析。然而，此应用受到转录因子的 ChIP 级抗体的可用性限制。如果 TF 抗体不可用，研究人员已经利用抗原决定簇标签的功能，以内源性方式在 TF 靶基因中插入一个标记。随后，标签抗体用于染色质免疫沉淀，然后进行测序，以确定内源性条件中的 DNA 结合位点和基序。

同样，内源性抗原决定簇标签也可用于研究天然条件下靶基因的表达和功能，而无需担心蛋白过表达的有害影响。

使用现有抗原决定簇标签蛋白质是简单的程序，能够让研究人员立即检测或纯化蛋白质。与使用针对目标蛋白直接产生的抗体相比，该技术有许多其他优势，如下所示：

• 最明显的优势是针对新型或免疫原性较弱蛋白所产生抗体的时间和费用。
• 多种经充分表征和验证的抗体（特别是单克隆抗体），可用于抗原决定簇标签。经验证，此类抗体对抗原决定簇标签具有特异性，从而可尽可能减少交叉反应。
• 可以在目标蛋白中添加多个标签，从而提升测定的检测限或灵敏度。
• 抗原决定簇标签在区分其他相似未标记蛋白方面非常有效，无须担心交叉反应抗体产生异常结果。
• 蛋白间相互作用研究可使用抗原决定簇标记的抗体进行。
• 研究人员可根据实验要求选择标签和插入位点类型，不会干扰蛋白的功能位点。

虽然抗原决定簇标签是用于研究蛋白间相互作用、功能和拓扑结构的常用技术，但其存在自身限制，如下所示：

• 在考虑标记目标蛋白时，应了解其基因序列。
• 抗原决定簇标签可能会干扰蛋白质结构和功能。
• 由于异源启动子会导致有害反映，表达水平可能出现异常。

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