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瞬时转染与稳定转染
不同转染方法在效率、细胞毒性、对细胞正常生理的影响以及基因表达水平等方面存在差异，因此并非所有方法都适用于所有细胞类型和实验。然而，所有转染策略大体可分为两类：瞬时转染和稳定转染。在瞬时转染中，核酸被导入细胞，并仅在细胞内短期存在。在稳定转染中，外源核酸可在细胞内长期维持，并可传递至转染细胞的子代细胞。以下内容对瞬时转染与稳定转染进行比较，并给出各自的推荐应用场景。
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瞬时转染
瞬时转染不会将核酸整合到基因组众，因此瞬时转染的遗传物质不会在细胞代际间传递。取决于所用构建体，转基因通常可在 1–7 天内检测到；但一般在转染后 24–96 小时进行收获，因为大多数外源 DNA 会在数天内被核酸酶降解或在细胞分裂过程中逐渐减少。
可能影响最佳收获时间的因素包括：
- 细胞类型
- 研究目标
- 导入基因的表达特性
- 报告基因达到稳态所需时间
瞬时转染如何起作用？
由于超螺旋质粒 DNA 更易被细胞摄取，因此瞬时转染通常使用超螺旋质粒 DNA 可获得更高效率。也可使用 siRNA、miRNA、mRNA 以及蛋白等其他分子，但需具有较高质量和纯度，以确保最佳转染效率。
在 DNA 转染中，DNA需进入细胞核内进行转录。相对地，转染的 RNA 停留在细胞质中：mRNA 可在数分钟内被翻译表达，而 siRNA 或 miRNA 可与 mRNA 结合以沉默靶基因。
由于导入细胞的遗传物质量较大，瞬时转染细胞通常可产生较高水平的蛋白表达。为分析基因产物的效应，可能需要分离 RNA 或蛋白以进行酶活性测定或免疫分析。
图 1：瞬时转染流程示例。转染的核酸仅在细胞内保留有限时间。
瞬时转染的应用
瞬时转染常用于细胞的短期改造，因为它比稳定转染更简单、更易操作。常用于：
重组蛋白表达
对哺乳动物细胞进行瞬时转染，可在小规模条件下快速获得正确折叠并具有翻译后修饰的重组蛋白，而这些在细菌表达系统中通常无法实现。
传统上，实现毫克到克级的重组蛋白表达常依赖于构建稳定细胞系。但近年来，对适应悬浮培养的 HEK293 和 CHO 细胞进行大体积瞬时转染，已能够满足对高产量重组蛋白的需求，无需再进行耗时的稳定细胞系构建过程。
通过瞬时转染进行重组蛋白表达，使研究者从目标载体及适应悬浮的 CHO 或 HEK293 细胞出发，在 3–7 天内即可获得毫克/升记、具有正确折叠和糖基化修饰的重组蛋白。
快速与超高产的蛋白生产
在许多药物发现应用中，瞬时转染有助于快速筛选蛋白构建体，可在不到一周的时间内同时评估多种候选分子。通常，瞬时转染会与资源投入更高的稳定细胞系构建同时进行，而后者完成往往需要三个月以上。
稳定转染
不同于外源 DNA 仅在细胞内持续数天的瞬时转染，稳定转染将 DNA 导入宿主细胞，从而无需重复转染即可实现持续、长期的基因表达。外源 DNA 可整合进细胞基因组，或以附加体（episomal 质粒）的形式存在，从而在多代细胞中维持并持续表达。
稳定转染适用于生产重组蛋白以及研究 DNA 的长期作用。然而，通常仅有少量 DNA 拷贝能整合到基因组中，，因此相较于瞬时转染，其表达水平往往较低。
稳定转染如何起作用？
成功的稳定转染需要高效的 DNA 递送，以及筛选能够摄取 DNA 的细胞的方法。
DNA 递送效率通常取决于细胞类型以及 DNA 为线性还是环状。在转染的细胞中，通常只有约万分之一的细胞能够实现 DNA 的稳定整合——线性 DNA 的摄取效率低于超螺旋 DNA，但更容易整合进宿主基因组。
稳定转染最常使用 DNA 载体，但 siRNA 和 miRNA 也可通过可筛选的 DNA 载体，以短发夹 RNA（shRNA）转录形式稳定导入细胞。仅靠 RNA 分子本身不能用于稳定转染。
可在 DNA 构建体上或在共转染的独立载体上加入筛选标记，以筛选稳定表达外源DNA 的细胞。短暂恢复后，对细胞施加选择压力。当使用共转染载体时，携带目标基因的载体与携带筛选标记的载体比例应为 5:1 至 10:1，以确保获得筛选标记的细胞同时也携带目的基因。
常见的筛选标记包括赋予筛选药物耐受性的基因，或可补偿细胞系中必需基因缺陷的基因。在选择培养基中，未转染或仅瞬时转染的细胞会死亡，而表达耐药基因或补偿必需基因缺陷的细胞则能存活。另外，也可利用表型或形态学变化作为可筛选特征。
筛选抗生素常用于施加选择压力。所选抗生素取决于转染实验中使用的耐药基因或筛选标记。
图 2：稳定转染流程示意图。转染的核酸可在细胞内长期存在。
稳定转染的应用
当需要长期基因表达，或需要在多次实验中反复使用转染细胞时，稳定转染比瞬时转染更为合适。由于 DNA 载体整合进染色体的过程属于低概率事件，细胞稳定转染更费时且更具挑战，需要筛选并进行克隆分离。
建立稳定细胞系的能力使稳定转染在实验与临床研究中具有重要价值。
稳定转染适用于以下情况：
- 生物技术与生物制药场景中的大规模蛋白生产
- 更长期的药理学研究
- 临床生物治疗
- 基因治疗
- 长期基因调控机制研究
- 基因治疗中的长期表达
选择瞬时转染还是稳定转染策略
请根据实验的时间周期与研究目标选择瞬时或稳定转染。
| 瞬时转染 | 稳定转染 |
|---|---|
| 更简单、耗力更少 | 更耗力，且需要使用筛选标记或抗生素 |
| 转染 DNA 不整合进基因组，而是保留在细胞核内 | 转染 DNA 整合进基因组 |
| 转染的遗传物质不会传递至子代细胞；遗传改变不是永久性的。表达持续时间有限。 | 转染的遗传物质可在细胞代际间稳定传递，遗传改变是永久性的。可支持长期基因表达。 |
| 不需要筛选 | 需要筛选以获得稳定转染细胞 |
| 瞬时转染可使用 DNA 载体和 RNA | 稳定转染只能使用 DNA 载体；仅靠 RNA 无法稳定导入细胞 |
| 转染遗传物质拷贝数高通常带来较高的蛋白表达水平 | 稳定整合 DNA 为单拷贝或低拷贝，导致蛋白表达水平较低 |
| 细胞通常在转染后 24–96 小时内收获 | 通常需要 2–3 周筛选以获得稳定转染克隆 |
| 通常不适用于使用诱导型启动子的研究 | 适用于使用可诱导型启动子的研究 |
| 用于需要对细胞进行临时改造的应用（例如 mRNA 的短暂表达、RNAi 分子的短暂表达） | 用于需要构建克隆细胞系的应用 |
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仅供科研使用，不可用于诊断目的。