Enzymes for Isothermal Amplification

关键样本的可靠扩增

等温扩增是在恒定温度下进行核酸指数扩增的可靠方法,无需进行热循环。其为扩增有限 DNA 样本量的理想技术,其灵敏度等于或高于基准常规 PCR 方法。核酸等温扩增方法在血液筛查、传染病诊断、癌症研究等方面的应用持续不断增长。

RT-LAMP protocol and application note for fast and simple RNA-based amplification of viral pathogens, including of SARS-CoV-2

Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) is an easy method for RNA-based amplification of viral pathogens. The RT-LAMP protocol includes reagents for fast and simple testing and surveillance of viral pathogens, including SARS-CoV-2. The workflow is easy to set-up, with a fast turnaround time, and only requires a simple heat source to maintain a constant temperature. A positive RT-LAMP reaction can be visualized by several methods (e.g. change in color and via agarose gel electrophoresis).

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Review full list of reagents described in the RT-LAMP protocol and application note

等温扩增相对于常规 PCR 的优势

  • 成本低,无需扩增设备
  • 减少污染概率
  • 对反应抑制剂的敏感性较低
  • 可用于即时检验(POCT)

EquiPhi29Bsm DNA 聚合酶可在环介导等温扩增 (LAMP) 和全基因组扩增 (WGA) 两种主要应用中进行灵敏可靠的等温扩增。

LAMP 是一种粗犷的、低成本的方法,用于特定的 DNA 检测,并具有可视化读数。特别适用于在野外快速诊断植物病原体或传染病原体。

LAMP 使用六种引物(相比 PCR 只使用了两种),使您可以将多个基因组序列区域作为特异性靶标(图1)。在等温条件下,DNA 合成起点数量的增加可提供更高的特异性和灵敏度。随着合成的开始,成对的引物形成环以促进每一轮扩增。

基于六种引物的环介导等温扩增 (LAMP) 引物设计,提高了特异性和灵敏度
图 1.LAMP 反应引物设计。

通常用于 LAMP 的酶是 Bsm DNA 聚合酶,其为 Bacillus smithii DNA 聚合酶的一部分,相当于 Bst DNA 聚合酶大片段。  它具有很强的链置换活性,最适温度为 60°C。Bsm DNA 聚合酶的扩增非常有效,可在短短15 分钟内复制 10 亿倍的 DNA 靶标。该酶对复杂样品中的抑制剂有很强的抵抗能力,所以植物组织、血液、尿液或唾液只需简单处理即可进行检测。

想要增加样本量有限的 DNA 靶标,等温全基因组扩增 (WGA) 是最有效的方法。[1] 特别是在需要多次重复实验的遗传疾病研究中特别有用。通过 WGA 扩增的 DNA 可以用于下游的二代测序、Sanger 测序、芯片基因分型和单核苷酸多态性 (SNP) 基因分型。[2] 目前已经开发出了多种 WGA 技术,它们的操作方法和易用性各不相同。

Phi29 DNA 聚合酶是进行 WGA 的首选酶。Thermo Scientific 可提供一种 改进型 EquiPhi 29 DNA 聚合酶,其是通过体外蛋白改造而开发的特殊 Phi29 DNA 聚合酶突变体。[3] 该酶在蛋白热稳定性、反应速度、产物产率和扩增偏好性方面明显优于常规 Phi29。此外,它保留了野生型酶的所有优点,包括高持续合成能力(扩增长达 70 kb)、强劲的链置换活性和 3'→5' 核酸外切酶(校正)活性。因此,推荐使用 exo-resistant random primer。表 1中将经典 Phi29 和EquiPhi 29 DNA 聚合酶做了比较。

表 1.Phi29 和 EquiPhi29 DNA 聚合酶相关数据比较。

 Phi29-类 DNA 聚合酶EquiPhi29 DNA 聚合酶
持续合成能力 / 链置换活性高(长达70kb)高(长达70kb)
最佳扩增温度30-37 °C42-45 °C
反应时间慢 – 长达 12h慢 – 长达 3h
校正活性3′→5′ (低错误率)3′→5′ (低错误率)
准确度高(低错误率)高(低错误率)
产量非常高
序列偏好性低偏好性、长片段(整个基因组)均匀扩增极低偏好性,包括高 GC 和 AT 含量模板(数据适用于0.5 ng 的起始材料)

与其它 WGA 商业化试剂相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶还可以实现时间更短、速度更快的多重置换扩增 (MDA) 方案。 动手操作时间大约 30 分钟,整个流程时间大约是 2 个小时(图2)。

EquiPhi29 DNA 聚合酶

在与其它同类 Phi29 DNA 聚合酶的研究中,EquiPhi29 DNA 聚合酶在扩增高 GC 含量靶标时偏好性最低(图1),并且无论是从 DNA 质粒(图3)还是从整个基因组DNA(图4),均可在 2 小时内扩增获得最高产量的靶序列。

当扩增3个细菌基因组时,EquiPhi29 DNA 聚合酶显示出较低的 GC 偏好性

图 3.当扩增3细菌基因组时,EquiPhi29 DNA 聚合酶显示出较低的 GC 偏好性。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及来自另一个供应商的 DNA 聚合酶,扩增具有低 GC 含量(S. aureus,33%GC)、中等 GC 含量(E. coli,51%GC)和高 GC 含量(P. aeruginosa,68%GC)细菌基因组的混合物。对于每个基因组,参考基因组的 GC 含量(以 100 bp windows 表示,灰色)被转换成未扩增基因组混合物的归一化的覆盖率(绿色)。在没有序列偏好性的情况下,所有 windows 应均匀分布且归一化覆盖度接近 1,以浅蓝色表示。使用不同聚合酶扩增后得到的归一化覆盖率。与其它 DNA 聚合酶相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶在所有 GC 含量范围内均可以最低的 GC 偏好性扩增 DNA(EquiPhi29 DNA 聚合酶以黄色表示)。

与其它供应商的产品相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶可以更快的速度获得更高产量的基因组DNA。

图 4.与其它供应商的产品相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶可以更快的速度获得更高产量的基因组DNA。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及其它供应商的 DNA 聚合酶,扩增 0.5 ng 的人类基因组DNA。使用磁珠纯化 DNA 产物,并使用 Qubit dsDNA BR Assay Kit 定量分析 DNA 产物。EquiPhi29 DNA 聚合酶的推荐反应温度为 42°C;但是,在 30°C 下孵育 4 小时,可以获得更高的产量。

LAMP 是一种粗犷的、低成本的方法,用于特定的 DNA 检测,并具有可视化读数。特别适用于在野外快速诊断植物病原体或传染病原体。

LAMP 使用六种引物(相比 PCR 只使用了两种),使您可以将多个基因组序列区域作为特异性靶标(图1)。在等温条件下,DNA 合成起点数量的增加可提供更高的特异性和灵敏度。随着合成的开始,成对的引物形成环以促进每一轮扩增。

基于六种引物的环介导等温扩增 (LAMP) 引物设计,提高了特异性和灵敏度
图 1.LAMP 反应引物设计。

通常用于 LAMP 的酶是 Bsm DNA 聚合酶,其为 Bacillus smithii DNA 聚合酶的一部分,相当于 Bst DNA 聚合酶大片段。  它具有很强的链置换活性,最适温度为 60°C。Bsm DNA 聚合酶的扩增非常有效,可在短短15 分钟内复制 10 亿倍的 DNA 靶标。该酶对复杂样品中的抑制剂有很强的抵抗能力,所以植物组织、血液、尿液或唾液只需简单处理即可进行检测。

想要增加样本量有限的 DNA 靶标,等温全基因组扩增 (WGA) 是最有效的方法。[1] 特别是在需要多次重复实验的遗传疾病研究中特别有用。通过 WGA 扩增的 DNA 可以用于下游的二代测序、Sanger 测序、芯片基因分型和单核苷酸多态性 (SNP) 基因分型。[2] 目前已经开发出了多种 WGA 技术,它们的操作方法和易用性各不相同。

Phi29 DNA 聚合酶是进行 WGA 的首选酶。Thermo Scientific 可提供一种 改进型 EquiPhi 29 DNA 聚合酶,其是通过体外蛋白改造而开发的特殊 Phi29 DNA 聚合酶突变体。[3] 该酶在蛋白热稳定性、反应速度、产物产率和扩增偏好性方面明显优于常规 Phi29。此外,它保留了野生型酶的所有优点,包括高持续合成能力(扩增长达 70 kb)、强劲的链置换活性和 3'→5' 核酸外切酶(校正)活性。因此,推荐使用 exo-resistant random primer。表 1中将经典 Phi29 和EquiPhi 29 DNA 聚合酶做了比较。

表 1.Phi29 和 EquiPhi29 DNA 聚合酶相关数据比较。

 Phi29-类 DNA 聚合酶EquiPhi29 DNA 聚合酶
持续合成能力 / 链置换活性高(长达70kb)高(长达70kb)
最佳扩增温度30-37 °C42-45 °C
反应时间慢 – 长达 12h慢 – 长达 3h
校正活性3′→5′ (低错误率)3′→5′ (低错误率)
准确度高(低错误率)高(低错误率)
产量非常高
序列偏好性低偏好性、长片段(整个基因组)均匀扩增极低偏好性,包括高 GC 和 AT 含量模板(数据适用于0.5 ng 的起始材料)

与其它 WGA 商业化试剂相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶还可以实现时间更短、速度更快的多重置换扩增 (MDA) 方案。 动手操作时间大约 30 分钟,整个流程时间大约是 2 个小时(图2)。

EquiPhi29 DNA 聚合酶

在与其它同类 Phi29 DNA 聚合酶的研究中,EquiPhi29 DNA 聚合酶在扩增高 GC 含量靶标时偏好性最低(图1),并且无论是从 DNA 质粒(图3)还是从整个基因组DNA(图4),均可在 2 小时内扩增获得最高产量的靶序列。

当扩增3个细菌基因组时,EquiPhi29 DNA 聚合酶显示出较低的 GC 偏好性

图 3.当扩增3细菌基因组时,EquiPhi29 DNA 聚合酶显示出较低的 GC 偏好性。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及来自另一个供应商的 DNA 聚合酶,扩增具有低 GC 含量(S. aureus,33%GC)、中等 GC 含量(E. coli,51%GC)和高 GC 含量(P. aeruginosa,68%GC)细菌基因组的混合物。对于每个基因组,参考基因组的 GC 含量(以 100 bp windows 表示,灰色)被转换成未扩增基因组混合物的归一化的覆盖率(绿色)。在没有序列偏好性的情况下,所有 windows 应均匀分布且归一化覆盖度接近 1,以浅蓝色表示。使用不同聚合酶扩增后得到的归一化覆盖率。与其它 DNA 聚合酶相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶在所有 GC 含量范围内均可以最低的 GC 偏好性扩增 DNA(EquiPhi29 DNA 聚合酶以黄色表示)。

与其它供应商的产品相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶可以更快的速度获得更高产量的基因组DNA。

图 4.与其它供应商的产品相比,EquiPhi29 DNA 聚合酶可以更快的速度获得更高产量的基因组DNA。使用 EquiPhi29 和 Phi29 DNA 聚合酶以及其它供应商的 DNA 聚合酶,扩增 0.5 ng 的人类基因组DNA。使用磁珠纯化 DNA 产物,并使用 Qubit dsDNA BR Assay Kit 定量分析 DNA 产物。EquiPhi29 DNA 聚合酶的推荐反应温度为 42°C;但是,在 30°C 下孵育 4 小时,可以获得更高的产量。

Lyo-Ready 格式

可冻干(Lyo-Ready )形式

EquiPhi29 和 Bsm DNA 聚合酶均可以可冻干(lyo-ready)的 OEM 形式提供,可为检测产品提供更多的灵活性、更长的保质期等。

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