TUNEL 检测赛默飞 | Thermo Fisher Scientific

TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记）检测是一种在分子生物学和细胞死亡研究领域广泛应用的技术。正在经历凋亡的细胞会表现出核形态的变化，包括DNA片段化、染色质浓缩、核膜降解、核皱缩以及DNA链断裂。Thermo Fisher Scientific提供的TUNEL检测能够帮助研究人员在组织样本或培养细胞中可视化并定量DNA片段化。此外，我们的检测方案设计兼容其他试剂和实验流程，便于检测更多细胞健康和活性参数。

什么是TUNEL检测？

在程序性细胞死亡（即凋亡）的晚期阶段，DNA会高度片段化。这种片段化为利用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）反应将修饰的dUTP连接到受损DNA的3’-OH末端提供了机会。修饰的dUTP，如BrdUTP或EdUTP，可以通过多种不同的检测策略进行检测。针对BrdUTP的抗体可用于间接检测，而直接检测则可通过掺入生物素或荧光修饰的核苷酸（如生物素-dUTP或荧光素-dUTP）实现。dUTP的修饰形式EdUTP则通过“点击”化学反应为检测策略提供了更大的灵活性。TUNEL检测已成为检测凋亡的广泛应用的原位检测方法。

利用点击化学的TUNEL检测

Click-iT TUNEL 试剂盒

传统的 TUNEL 检测方法是通过将 BrdUTP 掺入 DNA 中，然后通过多种方式进行检测。Thermo Fisher Scientific 开发了一种改良的 TUNEL 检测方法，该方法利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）将炔基修饰的 dUTP（EdUTP，见图 1）掺入到断裂 DNA 的 3'-OH 末端。在 Invitrogen Click-iT TUNEL 检测中，对掺入的核苷酸的检测是通过点击化学实现的，这是一种基于铜催化叠氮-炔基环加成反应的方法，其高度特异性来源于叠氮和炔基反应对在生物分子、细胞、组织或模式生物中没有内源性存在。掺入的 EdUTP 可通过荧光或比色法进行检测。

图 1. Click-iT TUNEL 成像检测试剂盒中提供的 Click-iT EdUTP 核苷酸结构。

Click-iT TUNEL 成像检测的基本步骤如图 2 所示。样本处理后，对细胞或组织进行固定和通透，以保存晚期凋亡细胞，从而减少因细胞脱落和随后的丢失而导致的假阴性结果的可能性。随后，EdUTP 核苷酸在 TdT 的作用下迅速掺入断裂的 DNA 中。下一步是连接染料或生物素叠氮，之后可选择性地加入复染剂。与采用一步法掺入染料或生物素修饰核苷酸的检测方法相比，Click-iT TUNEL 成像检测所采用的两步法，在相同条件下两小时内可检测到更高比例的凋亡细胞（见图 3）。

图2 使用 Click-iT TUNEL 成像检测检测细胞凋亡。EdUTP 由 TdT 掺入 DNA 后，连接染料或生物素叠氮，并可选择性加入复染剂。

图3. 不同修饰型dUTP对检测到的凋亡细胞百分比的影响比较。HeLa细胞用0.5 μM的斯陶洛斯波林处理4小时。固定和透化后，按照厂家说明书分别使用Click-iT EdUTP、BrdUTP和两种不同的荧光素dUTP产品进行TUNEL成像检测。阳性百分比根据相应的阴性对照计算。成像和分析使用Thermo Fisher Scientific ArrayScan II进行。

Click-iT Plus TUNEL 检测

原始Click-iT TUNEL成像检测所涉及的检测化学反应依赖于铜的使用，我们发现生物分子对铜浓度表现出不同的敏感性。例如，用于催化点击化学反应的高铜浓度会影响与荧光蛋白（如GFP）多重检测的能力，因为蛋白的荧光会降低，或影响使用特异性结合肌动蛋白的化合物鬼笔环肽，其结合能力也会下降。为克服这些挑战，我们开发了Click-iT Plus TUNEL检测，将铜浓度优化，以在驱动检测反应的同时，保留荧光蛋白的信号并兼容鬼笔环肽的结合。

使用BrdU的TUNEL检测

APO-BrdU TUNEL检测是一种双色检测方法，用于标记DNA断裂和细胞总DNA，通过成像或流式细胞术检测凋亡细胞。Invitrogen APO-BrdU检测使用BrdU和TdT标记片段化DNA的3'-OH末端，类似于图2所述的TUNEL技术。随后使用Alexa Fluor 488标记的抗BrdU单克隆抗体检测BrdU。该检测还包括碘化丙啶，用于测定细胞总DNA含量，并提供固定的阳性和阴性对照细胞以评估检测性能。

Learn about 其他凋亡检测方法

	TUNEL 组织检测				TUNEL 培养细胞检测
	*Click-iT Plus TUNEL Assays for In Situ* Apoptosis Detection**			Click-iT TUNEL Colorimetric IHC Detection Kit	Click-iT TUNEL Alexa Fluor Imaging Assays for Microscopy and HCS
检测原理	这些检测方法利用 EdUTP（一种经修饰的 dUTP，带有一个小的、生物正交的炔基部分），该物质会被 TdT 酶掺入到断裂 DNA 的 3’-OH 末端。
应用	原位凋亡检测				通过温和点击反应检测凋亡
样本类型	针对组织样本进行了优化，也可用于贴壁细胞				培养细胞 / 固定细胞
读出信号	荧光			比色法	荧光
Label	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 647	Biotin	Alexa Fluor 488	Alexa Fluor 594	Alexa Fluor 647
Ex/Em (nm)	495/519	590/615	650/670	N/A	495/519	590/615	650/670
Standard filter set	FITC filter	Texas Red filter	Cy5 filter	N/A	FITC filter	Texas Red filter	Cy5 filter
Instrument platform	Fluorescence imaging microscopy High content analysis			Brightfield imaging microscopy	Imaging microscopy High content analysis
兼容性	可与GFP/鬼笔环肽多重标记			可与苏木素/甲基绿多重标记	使用标准荧光染料进行多重标记不建议与荧光蛋白或鬼笔环肽进行多重标记
Fixation	Required (mild fixation and permeabilization)
	See all Click-iT Plus TUNEL Assays			C10625	See all Click-iT TUNEL Alexa Fluor Assays

用于组织分析的TUNEL检测

Click-iT Plus TUNEL 荧光检测法

Invitrogen Click-iT Plus TUNEL 体内凋亡检测试剂盒已针对组织切片进行了优化，尽管也可用于贴壁细胞。该基于荧光的检测方法兼容GFP及其他荧光蛋白，并可与鬼笔环肽（phalloidin）进行多重标记，如图4所示。Click-iT Plus TUNEL 检测可产生明亮、光稳定的荧光信号，并可选用Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 647叠氮试剂。

5 panel images of mouse intestinal muscle tissue section showing multiplex ability of TUNEL assay with other fluorescent probes

图4. Click-iT Plus TUNEL 检测可与多种其他荧光探针进行多重标记。来自表达GFP的小鼠肠道肌肉的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织经DNase I处理后, followed by the Click-iT Plus TUNEL Assay with Alexa Fluor 594 dye, and then stained with Hoechst 33342 dye and Alexa Fluor 647 Phalloidin. (A) 细胞核被Hoechst 33342染料（蓝色）染色，(B) 周围肌层检测到GFP信号（绿色），(C) 丝状肌动蛋白被Alexa Fluor 647鬼笔环肽（紫色）染色，(D) DNase I处理后由Click-iT Plus TUNEL检测和Alexa Fluor 594染料（红色）明确显示TUNEL阳性信号。最后一个面板(E)为四种荧光信号叠加后的多重标记图像。

Click-iT TUNEL 比色检测法

Invitrogen Click-iT TUNEL 比色IHC检测试剂盒已针对利用生物素叠氮和链霉亲和素-过氧化物酶偶联物在组织中识别凋亡细胞进行了优化，尽管也可用于贴壁细胞。在EdUTP掺入DNA断裂位点后（见图5），EdUTP被生物素叠氮标记。随后加入链霉亲和素-过氧化物酶和DAB（过氧化物酶底物）后，会产生可通过光学显微镜检测并可长期保存的深棕色信号。该检测还可与其他比色组织染色进行多重标记（见图6）。

EdUTP掺入DNA后连接生物素叠氮，链霉亲和素-过氧化物酶与生物素结合，并在加入DAB后显色的示意图

图5. Click-iT TUNEL 比色IHC检测试剂盒的实验流程. EdUTP掺入DNA后连接生物素叠氮，随后链霉亲和素-过氧化物酶与生物素结合，加入DAB后产生有色产物。

图6. 小鼠组织切片使用比色Click-iT TUNEL凋亡检测法进行标记。取一张8微米的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）小鼠胸腺切片， 使用 Click-iT TUNEL Colorimetric IHC Detection Kit 进行DAB标记以显示凋亡细胞（深棕色细胞核）。随后用伊红Y（粉色）染色组织，再用甲基绿（蓝色）对细胞核进行复染，脱水后用Thermo Scientific Cytoseal 60封片剂进行硬封片。明场图像通过EVOS FL Auto成像系统配备的彩色相机和20倍物镜采集。

培养细胞的TUNEL检测

Invitrogen Click-iT TUNEL Alexa Fluor成像检测盒已针对高内涵筛选（HCS）和显微镜下培养细胞成像进行了优化。其小巧且特异性的标记基团使实验流程快速高效。整个检测过程可在2小时内完成，并能高效区分群体中即使是高比例的凋亡细胞。Click-iT TUNEL检测可选择不同荧光标记，支持与表面及细胞内生物标志物的多重检测。对于细胞骨架检测，我们建议使用一抗而非鬼笔环肽（见图7）。同时，不建议与荧光蛋白联合使用。该检测已在HeLa、A549和CHO K1细胞中用多种诱导凋亡的试剂（包括斯陶洛斯波菌素）进行测试，并与基于抗体的其他凋亡标志物检测（如裂解的多聚ADP核糖聚合酶（PARP）、裂解的半胱天冬酶-3和磷化组蛋白2B）进行多重检测。此外，该方法也成功检测了通过siRNA敲低DEC2转录因子在人MCF-7乳腺癌细胞中诱导的凋亡（1）。

图7.使用Click-iT TUNEL成像检测法观察晚期凋亡。HeLa细胞经斯陶洛斯波菌素处理后固定并透化。 The Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647 Imaging Assay was performed. Activated caspase-3 was detected with a rabbit polyclonal primary antibody for cleaved caspase-3 and labeled with Alexa Fluor 488 goat anti–rabbit IgG antibody (green). 微管蛋白通过小鼠单克隆抗微管蛋白抗体检测，并用Alexa Fluor 555羊抗小鼠IgG（橙色）标记。细胞核用Hoechst 33342（蓝色）染色。浅蓝色为半胱天冬酶（绿色）、Hoechst（蓝色）和TUNEL（品红色）信号的叠加效果。

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	APO-BrdU TUNEL Assay Kit, with Alexa Fluor 488 Anti-BrdU
Basis of assay	The assay utilizes BrdU, which is incorporated at the 3’-OH ends of fragmented DNA by the TdT enzyme.
Application	Apoptosis detection occurs via an Alexa Fluor 488 dye-labeled anti-BrdU antibody
Sample type	Fixed cells Can also be used for adherent cells
Readout	Fluorescent
Label	Alexa Fluor 488
Ex/Em (nm)	490/525
Standard filter set	FITC filter
Nuclear counterstains	Propidium iodide
Instrument platform	Flow cytometry Fluorescence imaging microscopy
Fixation	Required
	A23210

流式细胞术用TUNEL检测

用于荧光检测的APO-BrdU TUNEL检测

Invitrogen APO-BrdU TUNEL检测试剂盒是一种用于标记DNA断裂的双色检测方法。该试剂盒已针对培养细胞的流式细胞术进行了优化，虽然也可用于在诱导凋亡后经胰酶消化的贴壁细胞。试剂盒包含碘化丙啶，用于分析总DNA含量，并提供固定的阳性和阴性对照细胞样本，以评估检测性能。该方案也可适用于荧光显微镜，但建议在抗体染色后、碘化丙啶/RNase处理前将细胞置于载玻片上。

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