PCR扩增实验-PCR步骤-赛默飞 | Thermo Fisher Scientific

PCR实验中的常见问题主要与以下几个因素有关：反应条件、序列准确性、扩增得率和特异性。本页将介绍出现这些问题的可能原因以及我们对于解决这些问题的建议。

本页内容：

可能原因	建议
DNA模板
完整性较差	在分离DNA时，尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要，可通过凝胶电泳检测模板DNA完整性。将DNA保存于分子级别的水或 TE缓冲液（pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。
低纯度	使用纯化试剂盒分离模板DNA时，应严格遵循试剂盒生产商的建议。查阅用户手册和疑难问题指南，改善较低的DNA质量。如果采用化学或酶促DNA纯化方案，应确保无PCR抑制剂残留，如苯酚、EDTA和蛋白酶K。使用70%乙醇再纯化或沉淀和洗涤DNA，去除可能会抑制DNA聚合酶的残留盐分或离子（如， K⁺, Na⁺等）。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类聚合酶对土壤、血液和植物组织携带的常见PCR抑制剂具有较好的耐受性。
用量不足	检查 DNA起始量，如有需要适当增加起始量。选择具有高灵敏度的DNA聚合酶用于扩增。适当增加PCR循环数。
复杂的目的片段（如，高GC含量或含二级结构）	选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难靶标。使用 PCR添加剂或辅助溶剂，促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。增加变性时间或温度，从而高效解离双链DNA模板。
长片段	确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为长片段PCR设计的DNA聚合酶。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性。根据扩增子长度，增加延伸时间。
引物
设计存在问题	查看引物设计。使用在线引物设计工具。确保引物针对目的片段具有特异性。确认引物与正确的目标DNA链互补。
引物陈旧	将引物重悬和分装，并妥善保存。将新鲜的引物分装，或按需购买新的引物。
用量不足	优化引物浓度（范围通常为0.1–1 μM）。对于长片段PCR和使用简并引物的PCR，最小起始浓度为 0.5 μM。
其它反应组分
DNA聚合酶不合适	使用热启动DNA聚合酶，防止校正DNA聚合酶的3’→5’核酸外切酶活性导致引物降解。热启动DNA聚合酶还能消除非特异性扩增，从而提高目的PCR产物的得率。或者，在冰上配制PCR反应体系，或在反应混合物中最后添加DNA聚合酶。
DNA聚合酶用量不足	选择具有高灵敏度的DNA聚合酶用于扩增。核对PCR使用的 DNA聚合酶推荐用量，并根据需要进行优化。如果反应混合物含有高浓度的添加剂（如，DMSO、甲酰胺）或样品来源抑制剂，可提高DNA聚合酶用量。
Mg²⁺ 浓度不足	优化 Mg²⁺ 浓度，以获得最高的PCR得率。若存在EDTA、其它金属螯合剂或非寻常的高浓度dNTP，则需要提高 Mg²⁺浓度。查看DNA聚合酶对镁盐溶液的偏好性。例如， Pfu DNA聚合酶与MgSO₄ 结合使用的效果比 MgCl₂更好。
PCR添加剂或辅助溶剂过多	查看PCR添加剂或辅助溶剂的推荐浓度。尽量使用最低浓度。调整退火温度，因为高浓度的PCR添加剂或辅助溶剂会削弱引物与目的片段的结合。增加DNA聚合酶用量，或使用具有高合成能力的DNA聚合酶。考虑使用专为指定DNA聚合酶设计的特殊添加剂或辅助溶剂（如， Invitrogen™ Platinum™ DNA聚合酶附带的GC增强剂）
反应混合物中的dUTP或经修饰的核苷酸	确保选定的DNA聚合酶能够掺入经修饰的核苷酸。优化经修饰的核苷酸与dNTP的比例，从而提高PCR扩增效率。
不均匀的试剂	将试剂储液与制备反应组分充分混合，消除保存和反应配制期间可能形成的密度梯度。
热循环条件
变性效果不理想	优化 DNA变性时间和温度。变性时间短、温度低可能无法获得良好的双链DNA模板解离效果。相反，变性时间长、温度高可能会降低酶活性。
退火效果不理想	尽量使用梯度热循环仪，以1–2°C增量逐步优化退火温度。最佳退火温度通常比最低引物T_m低 3–5°C。当使用 PCR 添加剂或辅助溶剂时，应调整退火温度。使用指定DNA聚合酶在其最佳缓冲液中的推荐退火温度。DNA聚合酶不同，则引物对的退火温度也不同。
延伸效果不理想	选择适合于扩增子长度的延伸时间。在扩增长片段（如，>10 kb）时，降低延伸温度（如，降至68°C）可保持酶活性。使用具有高合成能力的DNA聚合酶，在较短的延伸时间内也能实现稳定的扩增。
PCR循环数不合适	调整循环数（通常为23-35个循环），以获得合适的PCR产物得率。如果DNA起始量低于10拷贝，则将循环数增加至40。

非特异性扩增或条带模糊

可能原因	建议
DNA模板
DNA起始量过多	查看最佳的DNA起始量。降低DNA起始量，减少非特异性PCR产物产生。
完整性较差	降解的DNA可能会在凝胶电泳中产生模糊条带或高背景。在分离DNA时，尽量减少对DNA的切断或切刻。如有需要，可在PCR开始前通过凝胶电泳检测模板DNA的完整性。将DNA保存于分子级别的水或 TE缓冲液（pH 8.0）中，防止被核酸酶降解。
复杂的序列（如，高GC含量或含二级结构）	选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难片段。使用 PCR添加剂或辅助溶剂，促进富含GC的DNA和具有二级结构的序列变性。增加变性时间或温度，从而高效解离双链DNA模板。
长片段	确认所选DNA聚合酶的长片段扩增能力。使用专为长片段PCR设计的DNA聚合酶。选择具有高合成能力的DNA聚合酶，这类酶能够在短时间内扩增长片段。降低退火和延伸温度，促进引物结合和提高酶热稳定性。根据扩增子长度，增加延伸时间。
引物
设计存在问题	查看引物设计。使用在线引物设计工具。确保引物对目的片段具有特异性，与模板其他区域的同源性极低。确保引物的3′末端不含互补序列或连续的G或C核苷酸，防止形成引物二聚体。避免引物含有直接重复序列，防止与目的片段结合时发生错配。考虑增加引物长度，提高特异性。考虑使用巢式PCR ，提高特异性。
用量过多	优化引物浓度（范围通常为0.1–1 μM）。高引物浓度会加剧引物二聚体的形成。
其它反应组分
DNA聚合酶过多	查看用于PCR的 DNA聚合酶推荐用量，并根据需要进行优化。
DNA聚合酶不合适	使用在室温下无活性而仅在高温激活后有活性的热启动DNA聚合酶，提高特异性。使用非热启动DNA聚合酶时，在冰上配制PCR反应体系，保持酶活性。
Mg²⁺ 浓度过高	确认Mg²⁺ 浓度并适当降低，防止产生非特异性PCR产物。优化每个引物对和目的DNA的 Mg²⁺ 。
热循环条件
变性不充分	当扩增富含GC的模板和具有二级结构的序列时，可增加变性时间和/或温度，使DNA有效解离。
退火温度错误	使用指定DNA聚合酶在其最佳缓冲液中的推荐退火温度。DNA聚合酶不同，引物对的退火温度规则也不同。
退火温度过低	升高退火温度，提高特异性。最佳退火温度通常比最低引物 T_m低 3–5°C。尽量使用梯度循环仪，以1–2°C增量逐步优化退火温度。考虑使用降落PCR ，提高特异性。
退火时间过长	缩短退火时间，尽量减少引物与非特异性序列的结合。
延伸温度过高	将延伸温度降低3-4°C，提高DNA聚合酶的热稳定性，特别是对于长片段PCR。
延伸时间不足	当扩增较长的DNA片段时，应增加延伸时间。设置一个时间充足（5-15分钟）的最终延伸步骤，以扩增全部靶标。
循环数过多	减少循环数，同时不能明显降低目标PCR产物的得率，防止非特异性扩增子的累积。

PCR产物中存在序列错误

可能原因	建议
DNA聚合酶的保真度较低	使用具有极高保真度的DNA聚合酶，获得的片段用于下游诸如克隆、测序和定点突变等实验应用。
Mg²⁺ 浓度过高	检查 Mg²⁺ 浓度，并按需降低浓度。浓度过高可能会使DNA聚合酶错误掺入核苷酸。
dNTP浓度不平衡	确保在反应中使用等摩尔浓度的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。核苷酸浓度不平衡，会增加PCR错误率。
循环数过多	在确保不明显降低目标PCR产物的得率时，适当减少循环数。循环数过多可能会增加错配核苷酸的掺入。适当增加 DNA 起始量，避免运行过多的循环数。
紫外线损伤DNA	使用长波紫外（360 nm）灯箱观察凝胶中的片段，尽可能缩短照射时间。如果使用短波（254–312 nm）灯箱，则将紫外照射时间缩短至几秒，并将凝胶放在玻璃或塑料板上。或者，使用具有更长激发波长（减少损伤）的染料使DNA显色。
测序错误	对DNA双链进行测序，验证测序结果的可靠性。样品尽量一式两份。

PCR产物末端存在序列错误。

可能原因	建议
引物设计存在问题	避免引物序列中包含直接重复序列，否则会使PCR产物末端发生序列错位，产生多个重复序列。
产物质量低	购买已经过纯化的PCR引物，去除5′端被截断的非全长DNA寡核苷酸。
核酸酶污染	使用分子级、无核酸酶的试剂配制PCR反应体系。在冰上配制反应体系，使可能存在的污染性核酸外切酶尽量保持低活性。
紫外线损伤DNA	使用长波紫外（360 nm）灯箱观察凝胶中的片段，尽可能缩短照射时间。如果使用短波（254–312 nm）灯箱，则将紫外照射时间缩短至几秒，并将凝胶放在玻璃或塑料板上。或者，使用具有更长激发波长（减少损伤）的染料使DNA显色。
测序错误	对DNA双链进行测序，验证测序结果的可靠性。样品尽量一式两份。

假阳性扩增

可能原因	建议
引物设计存在问题	避免引物包含互补或自我互补序列，否则会促进形成引物二聚体和发生自我齐聚反应及其后续扩增。
交叉污染	应遵循配制PCR反应体系的一般建议，避免在工作环境中产生DNA污染。
交叉污染	使用具有气溶胶屏障的移液器吸头。划分独立的工作区域，并且在每次使用后对该区域进行净化。使用防PCR残余污染技术，如 dUTP掺入和UDG处理。

关于更多疑难问题帮助，请访问我们的终点PCR和PCR引物支持中心或联系我们的技术支持团队。

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