基因编辑效率验证

  • 在继续处理下游应用之前，验证对照靶基因编辑效率并选择显示未来筛选实验中较高编辑效率水平的条件。
  • 为了预估混合细胞群中 CRISPR-Cas9 介导的编辑效率，请使用 GeneArt 基因组切割检测试剂盒，或进行 Ion Torrent 新一代测序或基于 Sanger 测序的分析。
  • 虽然基因组切割检测 (GCD) 检测提供了快速方法，可在编辑实验后评估插入缺失的形成效率，但对克隆到质粒中的扩增子进行编辑群体中的扩增子新一代测序 (NGS) 可更准确地估计编辑效率和插入缺失类型的百分比。
     

GeneArt 基因组切割检测 (GCD) 试验

  • 转染后，使用 GeneArt 基因组切割检测试剂盒  预估混合细胞群中 CRISPR-Cas9 介导的切割效率。
  • 您可以通过我们的 GeneArt CRISPR 搜索和设计工具设计和订购 GCD 试验的靶标特异性引物集，该工具可通过 thermofisher.com/crisprdesign 获得。
  • 要对阳性对照品进行 GCD 试验，您需要 表 1 中列出的引物。我们建议将通过 thermofisher.com/oligos 获取的 Invitrogen 定制 DNA 值或标准寡核苷酸用于 GCD 试验所需的靶标特异性引物集。
  • 在 96 孔板规格中开展 GCD 试验，并在 2% E-Gel 48 琼脂糖凝胶（48 孔）上并行分析多个经 gRNA 处理的样本。
  • 选择显示具有最高切割效率的克隆，以用于实验。请注意，显示最高切割效率的克隆可能并不总是具有最高表达最高的克隆。
  • 有关更多信息和详细方案，请参见《GeneArt 基因组切割检测试剂盒用户指南》。

 

表 1.阳性和阴性对照（非靶向）TrueGuide 合成 gRNA 序列的靶序列。

TrueGuide 合成引导 RNA 对照品*用于 GeneArt 切割检测 (GCD) 试验的引物
基因座靶点特异性 crRNA 序列正向 GCD 引物反向 GCD 引物
人类 AAVS1** 5’-GCCAGUAGCCAGCCCCGUCC-3’ 5’-GAATATGTCCCAGATAGCAC-3’ 5’-GTTCTCAGTGGCCACCCTGC-3’
人类 HPRT (ln)**5’-GCAUUUCUCAGUCCUAAACA-3’5’-ACATCAGCAGCTGTTCTG-3’5’-GGCTGAAAGGAGAGAACT-3’
人类 CDK4†5’-CACUCUUGAGGGCCACAAAG-3’5’-GCACAGACGTCCATCAGCC-3’5’-GCCGGCCCCAAGGAAGACTGGGAG-3’
小鼠 Rosa 26**5’-CUCCAGUCUUUCUAGAAGAG-3’5’-AAGGAGCGAGGGCTCAGTTGG-3’5’-GGTGAGCATGTCTTTAATCTACCTCG-3’
阴性对照（非靶标）5’-AAAUGUGAGAUCAGAGUAAU-3’不适用不适用
* 有 TrueGuide 合成 sgRNA 和 crRNA 规格可供选择（请参见 thermofisher.com/trueguide）。** 针对内含子的特异性。†靶向 5' 外显子。

 

序列分析

  • 有关 Sanger 测序的编辑效率分析，请参阅我们的应用说明（援引自以下网站：thermofisher.com/sangercrispr）。
  • 如果您富有新一代测序 (NGS) 和分析的经验，您可以使用条形码靶标特异性扩增子引物并使用几种经 gRNA 处理的样本进行多重分析。使用定制的阵列板规格进行 TrueGuide 合成 gRNA 转染时，使用 NGS 进行多重分析尤其有用。有关 NGS 分析的更多信息，请参阅 Ion Torrent 靶向测序解决方案：thermofisher.com/ionapliseqsolutions。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。