GST 标签

利用谷胱甘肽 S-转移酶（GST）、组氨酸（HIS）等亲和标签纯化蛋白质，可以纯化出具有已知和未知生化特性的蛋白质。因此，这种方法已成为确定未表征蛋白生物功能的广泛使用的研究工具。GST 是一种由 211 个氨基酸组成的蛋白（26 kDa），其 DNA 序列经常被整合到表达载体中，用于生产重组蛋白。该载体的表达结果是一种 GST标签融合蛋白，其中功能 GST 蛋白 (26 kDa) 与重组蛋白的 N 端融合。

因为 GST标签在翻译后迅速折叠成稳定的高溶解性蛋白质，因此与不含 GST标签的重组蛋白相比，含 GST标签的重组蛋白通常具有更高的表达量和溶解度。此外，GST标记的融合蛋白可根据GST (一种酶) 与其底物谷胱甘肽 (GSH) 的结合能力进行纯化或检测。

GST 标签融合蛋白的纯化

谷胱甘肽是一种三肽 (Glu-Cys-Gly) ，是谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) 的特异性底物。当还原型谷胱甘肽通过其巯基固定在固相支持物（如交联珠状琼脂糖）上时，可通过酶-底物结合反应捕获纯 GST 或 GST标签蛋白。

固定谷胱甘肽

固定化谷胱甘肽。 交联 琼脂糖与还原型谷胱甘肽结合。

在近中性缓冲液 (生理条件下) (如 Tris 缓冲盐水 (TBS) pH 值 7.5) 中结合最有效。由于结合依赖于保留 GST 的基本结构和酶功能，因此不能使用蛋白质变性剂。

在用亲和柱洗脱未结合的样品成分后，可通过加入过量的还原型谷胱甘肽，从谷胱甘肽柱上分离并回收（洗脱）纯化的 GST标签融合蛋白。游离型谷胱甘肽会竞争性取代与 GST 结合的固定型谷胱甘肽，使融合蛋白从亲和柱中分离出来。

该亲和系统通常可从粗细菌或哺乳动物细胞裂解物样品中获得纯度超过 90%的GST标签重组蛋白。基于谷胱甘肽的 GST标签融合蛋白亲和纯化可轻松实现小规模、中规模、大规模生产，产量可达微克、毫克或克级。

GST的分子量为26 kDa，比许多其他融合蛋白亲和标签大得多。由于文献中尚未充分说明的原因，GST 融合标签的结构往往会在蛋白质凝胶电泳（例如 SDS-PAGE）的变性和还原时发生降解。因此，GST 标签融合蛋白的电泳样品通常会在全尺寸融合蛋白下方出现阶梯状的低分子量条带。

当纯化后的重组蛋白不需要或不希望 GST标记时，如果在设计 DNA 载体时在蛋白质和 GST标签之间加入特定蛋白酶的裂解位点，就可以去除GST标记。例如， HRV 3C 蛋白酶可特异性裂解 Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln↓ -Gly-Pro 序列。

谷胱甘肽琼脂糖能够提供高产量和高纯度的 GST标签融合蛋白

谷胱甘肽琼脂糖可产生高产量和高纯度的 GST 标签融合蛋白。将含有过量表达 GST 的 大肠杆菌裂解液（总蛋白 14.4 mg）与来自不同供应商的 50 µL GSH 树脂孵育，并按照生产商的说明进行纯化。用Thermo Scientific Coomassie Plus Protein Assay 对树脂中洗脱的 GST（产量）进行定量。纯度通过染色凝胶泳道的密度测定法进行评估。M= 分子量标记；L= 裂解液载量；FT= 流过；E= 洗脱。

蛋白质制备 手册

在这本 32 页的手册中，您可以了解如何使用各种  Thermo Scientific 蛋白质生物学工具对蛋白质样品进行脱盐、缓冲液交换、浓缩和/或去除污染物，以及 其他蛋白质纯化方法 。

  • 重组蛋白纯化标签 
  • 使用针对去垢剂或内毒素去除而优化的树脂，有效去除特定污染物
  • 使用 Slide-A-Lyzer 透析盒和设备安全地 透析蛋白质样品 
  • 使用  Zeba spin 脱盐柱和脱盐板快速脱盐，同时实现高蛋白回收率
  • 使用 Pierce 蛋白浓缩仪快速浓缩稀释的蛋白样品

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其他 GST 标签蛋白技术

除了亲和纯化外，还可利用谷胱甘肽配体化学或 GST 标签特异性抗体，对 GST 标签融合蛋白进行其他应用：

  • 微孔板包被：谷胱甘肽包被或 GST 抗体微孔板可用于检测细胞裂解液中 GST 或 GST 融合蛋白的存在和浓度。由于微孔板经过预封闭，不需要对细胞裂解物进行初始纯化。此外，使用这些有 8 孔和 96 孔板规格的板来固定 GST 融合蛋白，有助于筛选血清中的融合蛋白抗体。   

GST与谷胱甘肽包被板结合

GST 与谷胱甘肽包被板结合。 Thermo Scientific Pierce  GST  微孔板 能够从粗制或半纯化的样品中捕获融合蛋白，用于各种类型的微孔板和报告基因检测。

  • 蛋白质相互作用沉降：特定的GST 标记蛋白和谷胱甘肽琼脂糖树脂是设计用于纯化、鉴定和测量特定蛋白相互作用复合物的试剂盒的基础。
  • 酶联免疫吸附试验（ELISA）或 蛋白印迹检测法：这些应用可以 使用抗 GST 抗体。

     

推荐阅读

Frangioni ， J.V. 和 Neel ， B.G.(1993).Solubilization and purification of enzymatically active glutathione s-transferase (pGEX) fusion proteins. Anal Biochem 210:179-87. 

Simons ， P.C. 和 VanderJagt ， D.L.(1977).Purification of glutathione S-transferases for human liver by glutathione-affinity chromatography. Anal Biochem 82:334-41. 

仅供科研使用，不可用于诊断目的。