细胞培养污染

要识别细胞培养中的污染，您必须了解所研究细胞的形态以及培养过程中可能接触到的潜在污染物。有了这些信息，您可以决定哪些方法最有效用于检测和监测细胞培养中的污染。这对于在污染变得难以控制之前及时发现任何潜在污染至关重要。

然而，一些生物污染物，如支原体，即使在定期监测下也极难检测，需要采用其他识别和处理方法。

了解更多关于支原体污染的信息

细胞培养污染可以通过显微镜下的细胞分析、微生物检测、细胞系鉴定和免疫染色等测试方法进行识别。可能需要采用多种方法来确定存在哪种污染物，或者是否存在多种污染物。

如果怀疑培养物暴露于潜在污染物，应对其进行污染检测。污染物检测也应作为常规培养流程中的例行操作。建议在实验开始前对细胞系或原代培养物进行检测，并定期分析所有细胞培养物是否存在潜在污染。

细菌是一类大型且广泛存在的单细胞微生物。它们的直径通常只有几微米，并且形状多样，从球形到杆状和螺旋形不等。由于细菌普遍存在、体积小且生长速度快，它们是细胞培养中最常见的污染物之一。

细胞培养中的细菌污染在感染后几天内即可通过目视检查轻松发现。

• 受感染的培养物通常呈现混浊（即浑浊），有时表面会有一层薄膜。
• 培养基的pH值突然下降也是常见现象。
• 在低倍显微镜下，细菌表现为细小、移动的颗粒分布在细胞之间，而在高倍显微镜下可以分辨出单个细菌的形态。

下方的模拟图像展示了被大肠杆菌污染的贴壁293细胞培养。

图1. 被大肠杆菌污染的贴壁293细胞的模拟相差显微图像。在低倍显微镜下，贴壁细胞之间的空隙中可见微小、闪烁的颗粒，但单个细菌并不容易区分（A图）。对黑色方框所圈区域进一步放大后，可以分辨出单个大肠杆菌细胞（B图），它们通常呈杆状，长度约为2微米，直径约为0.5微米。A图中黑色方框的每条边长为100微米。

虽然不如微生物污染常见，但许多细胞系与HeLa及其他快速生长细胞系的广泛交叉污染是一个已明确的问题，且后果严重。从值得信赖的细胞库中获取细胞系、定期检查细胞系的特性，并采取良好的无菌技术，都有助于避免交叉污染。DNA指纹图谱分析、核型分析和细胞亚型分析可以确定细胞培养物中是否存在交叉污染。

视频2：无菌技术：本视频重点介绍了为防止细胞培养受到污染应采取的步骤。

病毒是依赖宿主细胞进行复制的微观感染性因子。由于其极小的体积，很难在培养物和试剂中检测和去除。由于大多数病毒对宿主有非常严格的要求，通常不会对非宿主物种的细胞培养产生不良影响。然而，使用病毒感染的细胞培养物可能对实验室人员构成严重的健康威胁，尤其是在实验室中培养人类或灵长类细胞时。

可以通过电子显微镜、使用抗体组进行免疫染色、ELISA或使用适当病毒引物的PCR检测细胞培养物中的病毒感染。

真菌是广泛存在的真核生物，可以是单细胞或多细胞。为了繁殖，真菌会产生孢子，这些孢子释放后可以在许多富含营养的环境中生长——包括细胞培养基和基质。细胞培养中最常见的真菌污染来自霉菌和酵母菌。

酵母是真核单细胞微生物，属于真菌界，大小通常为几微米（常见），最大可达40微米（罕见）。

与细菌类似，酵母污染细胞培养时会使培养基变得浑浊，尤其是在污染较严重的情况下。被酵母污染的培养物在pH值上变化很小，直到污染变得严重时，pH值通常会上升。在显微镜下，酵母表现为单个卵圆形或球形颗粒，可能会出芽形成更小的颗粒。

图2. 293细胞在贴壁培养中接种24小时后被酵母污染的模拟相差图像。污染的酵母细胞表现为卵圆形颗粒，在复制过程中出芽形成更小的颗粒。

霉菌是真核微生物，属于真菌界，以多细胞丝状体（称为菌丝）生长。这些菌丝相互连接形成的网络含有基因相同的细胞核，称为菌落或菌丝体。

与酵母类似，细胞培养中的霉菌污染在初期阶段pH值较为稳定，随着污染加重和培养基变得更加浑浊，pH值会迅速上升。在显微镜下，菌丝通常表现为细长、丝状的结构，有时也会出现较为密集的孢子团。许多霉菌种类的孢子在休眠状态下能够在极端恶劣的环境中存活，只有在遇到适宜的生长条件时才会被激活。

抗生素和抗真菌剂不应在细胞培养中常规使用，因为持续使用会促使抗生素耐药菌株的产生，并允许低水平污染持续存在，一旦抗生素从培养基中移除，这些污染可能发展为大规模污染，并可能掩盖支原体感染及其他隐匿性污染。此外，一些抗生素可能与细胞发生交叉反应，干扰正在研究的细胞过程。

抗生素应仅作为最后手段，并且只用于短期应用，应尽快从培养物中去除。如果长期使用，应同时维持无抗生素培养作为对照，以帮助调查隐匿感染。

是否使用抗生素预防细胞培养污染，应根据研究者个人的需求和经验决定。下表为在细胞培养基中使用Gibco抗生素的一般指南。也有一些溶液同时使用一种或多种抗生素与抗真菌剂。对于所有培养基类型，抗生素和抗真菌剂的最佳浓度应通过实验确定。请始终参考抗生素和抗真菌剂产品说明书，以帮助确定工作浓度。

当不可替代的培养物发生污染时，研究人员可能会尝试消除或控制污染。

• 首先，确定细胞培养污染物是细菌、真菌、支原体还是酵母。
• 将受污染的培养物与其他细胞系隔离。
• 使用实验室消毒剂清洁培养箱和层流罩，并检查HEPA过滤器。
• 高浓度的抗生素和抗真菌剂对某些细胞系可能有毒，因此应进行剂量反应测试，以确定抗生素或抗真菌剂在何种浓度下会产生毒性。

以下是建议用于确定毒性水平和去除污染的操作流程：

1. 将细胞解离、计数，并在不含抗生素的培养基中稀释。将细胞稀释至常规传代所用的浓度。
2. 将细胞悬液分装到多孔培养板或几个小瓶中。在每个孔中加入不同浓度范围的选用抗生素。
3. 每天观察细胞是否有毒性表现，如脱落、空泡出现、融合度降低和细胞变圆等。
4. 当确定了有毒的抗生素浓度后，将细胞在抗生素浓度为有毒浓度的1至2倍以下的条件下传代培养2至3代。
5. 将细胞在无抗生素的培养基中培养一代。
6. 重复步骤4。
7. 将细胞在无抗生素的培养基中连续培养4至6代，以确定污染是否已被消除。

虽然不像微生物污染那样常见，但许多细胞系被其他快速生长的细胞系广泛交叉污染已成为一个明确存在且后果严重的问题。从信誉良好的细胞库获取细胞系、定期检查细胞系特性以及规范无菌操作，都是帮助您避免交叉污染的有效措施。DNA指纹分析、核型分析和同种型分析可以确认您的细胞培养中是否存在交叉污染。

Hassan, S., Ahmad, F. (2020). 抗生素补充剂在哺乳动物细胞培养中的相关性：迈向范式转变。Gulhane医学杂志，62，224-230。10.4274/gulhane.galenos.2020.871。