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•将Tris-甘氨酸转膜缓冲液的pH增加至9.2,可使pl低于9.2的所有蛋白质朝阳极方向迁移。 •使用Tris-甘氨酸转膜缓冲液,并在凝胶两侧各放一张膜。碱性高于转膜缓冲液pH的蛋白质,将被凝胶阴极侧的膜捕获。随后,可以用相同的方式处理两张膜。 •转印前,将凝胶置于含0.1% SDS的Tris-甘氨酸转膜缓冲液中孵育15分钟。少量的SDS会给予蛋白质足够的电荷,使蛋白质朝阳极端单向移动,并且在大部分情况下不会使蛋白质变性。然后,使用常规Tris-甘氨酸转膜缓冲液进行转印。
NuPAGE Bis-Tris凝胶在Invitrogen半干转仪中的转印效率不如在XCell II转印模块中高。如果您决定使用Invitrogen半干转仪进行NuPAGE -Tris凝胶转印,则应使用下述实验方案以确保蛋白质的有效转印。 1.如下所述,使用20X NuPAGE转膜缓冲液制备100 mL的2X NuPAGE转膜缓冲液: NuPAGE转膜缓冲液(20X)10.0 mL NuPAGE抗氧化剂(用于还原型样品)0.1 mL 甲醇10.0 mL 去离子水79.9 mL 总体积100 mL 如果您转印的是大分子蛋白质,请参见下方备注。 2.在转膜缓冲液中浸泡滤纸和印迹膜。如果您在使用Invitrogen预切膜/滤纸三明治,则应在凝胶或膜的外侧分别使用3张滤纸(每张滤纸厚0.4 mm)。如果您未使用Invitrogen预切膜/滤纸三明治,则使用2张厚滤纸。 3.将凝胶置于转膜缓冲液(中型凝胶使用100 mL,小型凝胶使用50 mL)中,放置在定轨摇床上平衡10分钟,从而去除转印液中的盐,以避免电导率和产热的增加。 4.如下所述,在阳极板上装配凝胶/膜/滤纸三明治: 滤纸 滤纸 滤纸 滤纸 膜 凝胶 凝胶 凝胶 5.在20 V恒定电压条件下转印30-60分钟。 备注:转印大分子量蛋白质(>100 kDa)时,可在装配三明治前,将凝胶置于含0.02-0.04% SDS 的2X NuPAGE转膜缓冲液(无甲醇)中预平衡10分钟。
以下是可能原因和解决方案: 膜的转印垫不干净或污染。使用转印垫前,用去污剂浸泡,然后用纯水彻底清洗。转印垫破损或变色后,则更换新的转印垫。 封闭不均匀。孵育皿必须足够大,使封闭液能够完全覆盖膜。每一步都需要摇动或搅动。
以下是可能原因和解决方案: - 膜被指纹或角蛋白污染:始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时,仅触碰膜的边缘。 - 二抗浓度较高:按照推荐方法稀释二抗。如果背景仍然很高,但条带强度也很高,则应降低二抗的浓度。 - 一抗浓度较高:降低一抗浓度。 -一抗对蛋白标准品具有亲和力:向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。 - SDS残留或转印后蛋白质与膜的结合较弱:遵循免疫检测前的膜准备说明。 - 封闭时间过短或洗膜时间过长:应确保每一步都达到指定时间。
以下是可能原因和解决方案: - 封闭不充分或发生非特异性结合:建议尝试使用我们的WesternBreeze封闭剂/稀释液(货号WB7050)。 - 膜污染:仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。 - PVDF膜本身具有较高的背景:改为使用硝化纤维素膜。 - 硝化纤维素膜未完全湿润:遵循预润湿膜的说明。 - 印迹膜显色过度:遵循推荐的显色时间,当达到可接受的信噪比时,从底物中取出印迹膜。 - 洗膜不充分:遵循推荐的洗膜次数。在一些情况下,可能有必要增加洗膜次数和时间。 - 二抗浓度较高:通过点印迹法确定最佳抗体浓度,必要时可稀释抗体。 - 一抗浓度较高:通过点印迹法确定最佳抗体浓度,必要时可稀释抗体。