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•将Tris-甘氨酸转膜缓冲液的pH增加至9.2,可使pl低于9.2的所有蛋白质朝阳极方向迁移。 •使用Tris-甘氨酸转膜缓冲液,并在凝胶两侧各放一张膜。碱性高于转膜缓冲液pH的蛋白质,将被凝胶阴极侧的膜捕获。随后,可以用相同的方式处理两张膜。 •转印前,将凝胶置于含0.1% SDS的Tris-甘氨酸转膜缓冲液中孵育15分钟。少量的SDS会给予蛋白质足够的电荷,使蛋白质朝阳极端单向移动,并且在大部分情况下不会使蛋白质变性。然后,使用常规Tris-甘氨酸转膜缓冲液进行转印。
氯丁醇可用作NuPAGE转膜缓冲液的防腐剂,但对于蛋白质的有效转印并不是必要的。若配制缓冲液时未加入氯丁醇,则应注意缓冲液不能长期稳定保存。建议在配制后2周内用完。
我们不建议使用碳酸盐或CAPS转膜缓冲液进行NuPAGE凝胶转印,因为这会降低转印效率。此外,这些缓冲液的高pH环境(>pH 9)会使NuPAGE抗氧化剂丧失功能。
为提高NuPAGE凝胶上大分子蛋白[高分子量蛋白]的转印效率,我们建议在安装“三明治”前,将凝胶置于含有0.02–0.04% SDS的2x NuPAGE转膜缓冲液(无甲醇)中预平衡10分钟,然后使用含甲醇和0.01%SDS的1XNuPAGE转膜缓冲液进行转印。
以下是可能原因和解决方案: -使用了浓度过高或错误的缓冲液。应检查缓冲液配方;必要时,稀释或重新配制。 -电压、电流或功率设置过高。将电源条件降低至推荐的电泳条件。