Reverse Transcription Troubleshooting Guide

逆转录产生RNA的互补DNA (cDNA) ，而cDNA可作为RNA研究中一系列下游应用的模板。因此，发现并避免cDNA合成过程中的潜在问题，对于保证实验结果的有效性至关重要。本页面提供的疑难解答提示适用于绝大多数常见的逆转录应用，尤其是（定量）逆转录PCR或RT-(q)PCR。

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RT-(q)PCR扩增量低或未扩增
可能的原因建议
RNA完整性低
  • 合成cDNA前，通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。
  • 尽量减少RNA样品反复冻融的次数，以防止降解。
  • 遵守实验室的最佳操作惯例，以避免RNase污染。
  • 在建立逆转录反应时加入RNase抑制剂。
  • 使用确认无核酸酶或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保无RNase。
  • 将RNA存储于EDTA缓冲溶液（0.1mM的EDTA，或10mM的Tris+1mM EDTA）中，以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。
  • 在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中，选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。
  • 考虑使用对已降解的RNA样品高度有效的逆转录酶。
RNA纯度低
  • 遵循特定来源（组织、血液和植物）样品RNA纯化方案。
  • 通过UV光谱法，读取一定波长范围的吸光度，评估RNA的纯度。
  • 检查RNA提取步骤。避免超过源材料推荐的用量，使样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确，以除去杂质和抑制剂。
  • 如有必要，在无核酸酶水中稀释起始RNA，以降低潜在的抑制剂浓度。
  • 如有必要，重新纯化RNA样品，以除去残留的盐和抑制剂。
  • 考虑使用耐受盐、残留生物抑制剂和提取试剂的抑制效应的逆转录酶。
GC含量高及/或二级结构
  • 在逆转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却。
  • 通过在较高的温度下（例如50℃）进行逆转录以最小化发夹序列形成的可能。
  • 使用能够承受高反应温度的热稳定逆转录酶。
低RNA量
不理想的逆转录酶
  • 为了提高cDNA的得率，选择具有更高灵敏度、持续合成能力、和耐受抑制剂的高效逆转录酶。高效逆转录酶非常适合于具有挑战性的RNA样品，如已降解或含抑制剂的样品。
  • 对于较短反应时间和较高反应温度的实验，分别使用具有高持续合成能力和高热稳定性的逆转录酶。
逆转录未达到理想时间和温度
不正确的引物设计
  • 针对特定的RNA模板，查看关于逆转录引物类型的建议。例如对于细菌RNA或缺乏poly(A)尾的RNA，以及可能降解的RNA，使用随机引物代替寡核苷酸（dT）引物。
  • 对于基因特异性的引物，确保引物的序列与靶序列的3' 端互补。
反应组分的质量（或稳定性）
  • 遵循制造商的建议存储和使用试剂。
  • 确保使用的试剂为新鲜配制，并适于所选择的逆转录酶。
  • 混合试剂能完全溶解可能已经沉淀的DTT和盐。
RT-(q)PCR非特异性扩增
可能的原因建议
基因组DNA (gDNA)污染
有问题的引物设计
  • 如果使用基因特异性引物，回顾引物设计的建议。验证引物的结合位点针对于目的基因的特异性。
  • 在较高的温度下进行逆转录，以帮助提高引物结合的特异性，并使用热稳定逆转录酶。
  • 在构建(q)PCR时，选择跨越外显子-外显子接点的PCR引物，以使cDNA特异性扩增。
cDNA截短
可能的原因建议
RNA完整性低
  • 合成cDNA前，通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。
  • 尽量减少RNA样品反复冻融的次数，以防止降解。
  • 遵守实验室的最佳操作惯例，以避免RNase污染。
  • 在构建逆转录反应时加入RNase抑制剂。
  • 使用确认无核酸酶或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保去除RNase。
  • 将RNA存储于EDTA缓冲溶液（0.1mM的EDTA，或10mM的Tris+1mM EDTA）中，以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。
  • 在灭活/去除所使用的DNA酶的过程中，选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。
  • 可考虑能在已降解的RNA样品中高效工作的逆转录酶
存在逆转录酶抑制剂
  • 遵循针对特定来 源的RNA纯化方案 ，比如组织、血液和植物。
  • 通过UV光谱法，读取跨越一定范围的波长的吸光度来评估RNA的纯度。
  • 检查RNA提取步骤。避免加入超过源材料的推荐用量，使得样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确，以除去抑制剂。
  • 如有必要，重新纯化RNA样本以去除残留的盐和抑制剂。
  • 如有必要，在无核酸酶水中稀释起始RNA，以降低潜在的抑制剂的浓度。
  • 对于盐、残留的生物抑制剂和提取试剂引起的抑制效应，可考虑使用具有耐受作用的逆转录酶。
高GC含量及/或二级结构
  • 在逆转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却。
  • 通过在较高的温度下（例如50℃）进行逆转录，最大限度降低发夹序列形成的可能。
  • 使用能够承受高反应温度的高热稳定性逆转录酶。
有问题的引物
  • 如果使用基因特异性引物，验证引物的结合位点靶向目的基因的唯一性。
  • 尽可能使用寡核苷酸（dT）引物进行全长cDNA的合成。
  • 对于可能降解的RNA，为了进行最有效的逆转录，可考虑随机引物。
  • 当使用随机引物时，优化引物浓度以获得长cDNA片段，同时保持高得率。
不理想的逆转录酶
  • 选择能够合成长cDNA的逆转录酶。这种类型的逆转录酶常表现出低RNase H活性、增强的持续合成能力以及对抑制剂的高耐受性。
cDNA pool代表性差（低覆盖率）
可能的原因建议
RNA丰度低
  • 使用能以最小偏差减少多余的RNA（比如核糖体RNA）并富集目的RNA（比如poly(A)尾RNA ）的RNA分离方法。
RNA完整性低
  • 合成cDNA前，通过凝胶电泳或微流控芯片技术对RNA完整性进行评估。
  • 尽量减少RNA样品反复冻融的次数，以防止降解。
  • 遵守实验室的最佳操作惯例，以避免RNase污染。
  • 在构建逆转录反应时加入RNase抑制剂。
  • 使用确认无核酸酶或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保去除RNase。
  • 将RNA存储于EDTA缓冲溶液（0.1mM的EDTA，或10mM的Tris+1mM EDTA）中，以尽量减小由具有金属离子辅酶因子的核酸酶造成的非特异性裂解。
  • 在灭活/去除所使用的DNas的过程中，选择对RNA完整性的影响最小的基因组DNA去除方案。
  • 考虑能高效处理已降解RNA样品的逆转录酶
RNA纯度低
  • 遵循针对特定来源（如组织、血液和植物）样品RNA的纯化方案 。
  • 通过UV光谱法读取一定波长范围的吸光度，评估RNA的纯度。
  • 检查RNA提取步骤。避免超过源材料的推荐的用量，使得样品充分裂解并尽量减少抑制剂残留。确保洗涤步骤正确，以除去杂质和抑制剂。
  • 如有必要，重新纯化RNA样品，以除去残留的盐和抑制剂。
  • 考虑使用可耐受盐、残留的生物抑制剂和提取试剂引起的抑制效应的逆转录酶。
高GC含量及/或二级结构
  • 在逆转录之前，在65℃加热RNA 5min，使二级结构变性，然后在冰上迅速冷却。
  • 在较高的温度下（例如50℃）进行逆转录，最大限度减少发夹序列形成的可能。
  • 使用能够承受高反应温度的热稳定逆转录酶。
引物有问题
  • 优化引物混合物和浓度（例如，寡聚（dT）和随机六聚体），以减少偏差和增加对不同靶序列的检测效果。
  • 对于可能降解的RNA，选择随机引物以确保适当的覆盖率。
逆转录未达到理想时间和温度
不理想的逆转录酶
  • 选择具有更高灵敏度、持续合成能力和热稳定性的高效逆转录酶。这些酶的性能可以检测低丰度的RNA、长链转录物、已降解样品及含有抑制剂的模板。
  • 对于较短反应时间和较高反应温度，分别使用具有高持续合成能力和改善热稳定性的逆转录酶。
cDNA测序错误
可能的原因建议
不理想的逆转录酶
  • 检查所用的逆转录酶的错误率或保真度。此外，通过高质量的读长、配对末端测序及样本重复验证测序结果的可靠性。
基因组DNA污染 (gDNA)
  • 采用没有逆转录酶的对照反应（减少RT或无RT对照），通过PCR检查gDNA污染。
  • 在逆转录前用DNase处理RNA样本。在灭活/去除所选DNase ，可考虑能可最大限度减少RNA非特异性降解的gDNA去除步骤。
  • 如果PCR扩增的cDNA已测序，选择跨越外显子-外显子接点的PCR引物，以使cDNA特异性扩增。

更多疑难解答提示，请访问我们的逆转录和RACE支持中心、cDNA文库及其构建以及高通量测序支持中心，或者联系我们的技术支持团队。

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