蛋白质电泳概述

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蛋白质电泳是一种标准的实验室技术，通过电场将带电的蛋白质分子在溶液中迁移。蛋白质和核酸都可以通过电泳进行分离，这是一种简单、快速且灵敏的分析工具。大多数生物分子在除其等电点以外的任何pH值下都带有净电荷，并且会以与其电荷密度成正比的速度迁移。分子在电场中的迁移速度取决于以下因素：电场强度、分子的净电荷、分子的大小和形状、离子强度以及分子迁移的基质属性（如粘度、孔径）。聚丙烯酰胺和琼脂糖是电泳中常用的两种支撑基质。这些基质作为多孔介质，具有类似分子筛的作用。琼脂糖孔径较大，适合分离核酸和大型蛋白质复合物。聚丙烯酰胺孔径较小，非常适合分离大多数蛋白质和较小的核酸。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有多种形式，每种形式都能提供关于目标蛋白不同类型的信息。变性和还原的十二烷基硫酸钠PAGE（SDS-PAGE）采用不连续缓冲系统，是最广泛使用的电泳技术，主要按质量分离蛋白质。非变性PAGE，也称为天然PAGE，根据蛋白质的质量/电荷比进行分离。二维（2D）PAGE在第一维按天然等电点分离蛋白质，在第二维按质量分离蛋白质。

SDS-PAGE主要按质量分离蛋白质，因为离子型去污剂SDS能够使蛋白质变性并结合，使其带有均一的负电荷。因此，当电流通过时，样品中所有结合SDS的蛋白质都会向正极迁移。由于凝胶基质的筛分效应，质量较小的蛋白质比质量较大的蛋白质迁移得更快。蛋白质通过电泳分离后，可以用各种染料在凝胶中检测，也可以转移到膜上进行免疫印迹（western blot）检测，或切割并提取用于质谱分析。因此，蛋白质凝胶电泳是许多蛋白质组学分析的基础步骤。

聚丙烯酰胺是制备用于按分子大小分离蛋白质的电泳凝胶的首选材料。聚丙烯酰胺凝胶通过将丙烯酰胺与双丙烯酰胺混合，在加入聚合剂过硫酸铵（APS）后形成交联聚合物网络。TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺）通过促进APS产生自由基来催化聚合反应。在这个阶段，它就变成了聚丙烯酰胺。

传统聚丙烯酰胺凝胶的示例配方：用于SDS-PAGE的10% Tris-甘氨酸迷你凝胶：

• 7.5毫升40%丙烯酰胺溶液
• 3.9毫升1%双丙烯酰胺溶液
• 7.5毫升1.5 M Tris-HCl，pH 8.7
• 加水至30毫升
• 0.3毫升10%过硫酸铵（APS）
• 0.3毫升10%十二烷基硫酸钠（SDS）
• 0.03毫升TEMED

凝胶中形成的孔径大小与聚丙烯酰胺的百分比（浓度）成反比。例如，7%聚丙烯酰胺凝胶的孔径比12%聚丙烯酰胺凝胶要大。低浓度的凝胶用于分离大分子蛋白，高浓度的凝胶用于分离小分子蛋白。“梯度凝胶”是特殊制备的，在顶部（样品路径的起点）具有较低的聚丙烯酰胺百分比，而底部（终点）具有较高的百分比，从而能够分离更广泛范围的蛋白质大小。

电泳凝胶是在能够让电流通过基质的缓冲液中配制的。配好的溶液被倒入由两块玻璃或塑料板组成的夹板之间的薄空间，这一过程称为凝胶灌注。凝胶聚合后，夹板被安装（通常是垂直放置）到仪器中，使上下边缘分别与含有阴极和阳极的缓冲液室接触。运行缓冲液含有能够通过凝胶传导电流的离子。当蛋白质被加载到顶部边缘的孔中并施加电流时，蛋白质会被电流带动通过基质板，并根据凝胶的筛分特性进行分离。

为了获得最佳的蛋白质分辨率，会在分离凝胶的顶部灌注一层堆积凝胶。堆积凝胶的丙烯酰胺浓度较低（例如，大孔径时为7%），pH较低（例如为6.8），并且具有不同的离子成分。这使得加载样品中的蛋白质在电泳的最初几分钟内能够集中成一个紧密的带，然后进入凝胶的分离部分。如果使用梯度凝胶，则不需要堆积凝胶，因为梯度本身就能实现这一功能。

SDS-PAGE

在SDS-PAGE中，凝胶是在含有十二烷基硫酸钠（SDS，一种阴离子去污剂）的缓冲液中制备的。SDS通过包裹多肽主链来变性蛋白质。将蛋白样品在70-100°C的条件下与过量的SDS和巯基试剂一起加热，可以断裂二硫键，使蛋白质完全解离为其亚基。在这些条件下，大多数多肽以恒定的重量比（1.4克SDS：1克多肽）结合SDS。与结合的去污剂所带的负电荷相比，多肽本身的电荷可以忽略不计，因此SDS-多肽复合物基本上具有相同的负电荷和形状。因此，蛋白质在凝胶中的迁移完全取决于多肽的大小，组成差异的影响极小。这种方法的简便和快速，以及只需微克级别的蛋白质样品，使SDS-PAGE成为测定多肽样品分子质量最广泛使用的方法。几乎任何来源的蛋白质都能被SDS轻松溶解，因此该方法具有广泛的适用性。

当一组已知质量的蛋白质与样品一起在同一凝胶中运行时，它们为样品蛋白质的质量测定提供了参考。这些参考蛋白质集合被称为质量标记或分子量标记（MW标记）、蛋白质梯度或尺寸标准，并且以多种形式在商业上可获得。

在原生PAGE中，蛋白质根据其天然结构的净电荷、大小和形状进行分离。电泳迁移发生的原因是大多数蛋白质在碱性运行缓冲液中带有净负电荷。负电荷密度越高（每分子质量上的电荷越多），蛋白质迁移速度就越快。同时，凝胶基质的摩擦力产生筛分效应，根据蛋白质的大小和三维形状调节其运动。小蛋白质只受到较小的摩擦力，而大蛋白质则受到较大的摩擦力。因此，原生PAGE根据蛋白质的电荷和质量进行分离。

由于原生PAGE不使用变性剂，多聚体蛋白质的亚基间相互作用通常得以保留，并且可以获得关于四级结构的信息。此外，一些蛋白质在原生PAGE分离后仍能保持其酶活性（功能）。因此，该技术可用于制备纯化的、活性的蛋白质。

电泳后，可以通过被动扩散或电洗脱从原生凝胶中回收蛋白质。为了在电泳过程中保持蛋白质的完整性，重要的是保持仪器冷却，尽量减少变性和蛋白水解。在原生PAGE中一般应避免极端pH，因为这可能导致不可逆损伤，如变性或聚集，从而影响目标蛋白质。

一维聚丙烯酰胺凝胶电泳

最常见的蛋白质凝胶电泳形式是通过一维（1D）电泳对多个样品进行比较分析。凝胶尺寸范围从2 x 3厘米（微型）到15 x 18厘米（大格式）。最受欢迎的尺寸（约8 x 8厘米）通常被称为“迷你凝胶”。中等尺寸的凝胶（8 x 13厘米）称为midi凝胶。小型凝胶比大型凝胶耗时和试剂更少，适合快速蛋白筛选。然而，大型凝胶具有更好的分辨率，适用于分离相似蛋白或大量蛋白。

蛋白样品被加入到凝胶顶部的样品孔中。当电流施加时，蛋白质会通过凝胶基质向下移动，形成所谓的蛋白带泳道。相邻孔中加载的样品一起进行电泳后，经过染色或其他检测方法，便于彼此比较。蛋白带的染色强度和厚度反映了它们的相对丰度。各泳道内蛋白带的位置（高度）则显示了它们的相对大小（以及其他影响其在凝胶中迁移速度的因素）。

二维电泳（2D-PAGE）可以最全面地分离单一样品中的多种组分。第一维利用等电聚焦（IEF）这种电泳方式，根据蛋白质的天然等电点（pI）进行分离。第二维则利用常规的SDS-PAGE根据分子质量进行分离。二维电泳为蛋白质分析提供了最高的分辨率，是蛋白质组学研究中的一项重要技术，有时需要在一块凝胶上分辨数千种蛋白质。

进行等电聚焦（IEF）时，通过使用专门配制的缓冲体系或两性电解质混合物，在管状或条状凝胶中建立pH梯度。现成的IEF条状凝胶（称为固定化pH梯度条或IPG条）及所需仪器可从某些制造商处获得。在IEF过程中，蛋白质在条带内迁移，最终聚焦在其净电荷为零的pH点上，这些点即为其各自的等电点。

随后，将IEF条带横向放置在普通一维凝胶的顶部，使蛋白质在第二维中根据大小进一步分离。

电泳实验需要三种基本类型的缓冲液：凝胶配制缓冲液、样品缓冲液以及用于填充电极槽的运行缓冲液。电泳可以采用连续或非连续缓冲体系进行。连续缓冲体系在凝胶、样品和凝胶槽中仅使用一种缓冲液，这种体系最常用于核酸分析，很少用于蛋白质凝胶电泳。在连续缓冲体系中分离的蛋白质通常较为弥散，分辨率较低。相反，非连续缓冲体系则使用不同的凝胶缓冲液和运行缓冲液。这些体系还采用两层不同孔径和不同缓冲成分的凝胶（即浓缩胶和分离胶）。采用非连续缓冲体系进行电泳可以使样品浓缩，提高分辨率。常用的几种非连续凝胶缓冲体系总结如下。

Tris-甘氨酸

分离广泛范围蛋白质最常用的凝胶体系是Laemmli体系。经典的Laemmli体系由Tris-甘氨酸凝胶和Tris-甘氨酸运行缓冲液组成，可用于SDS-PAGE和天然PAGE。这一体系被广泛采用，因为用于配制Tris-甘氨酸凝胶的试剂价格低廉且易于获得。采用这种化学体系的凝胶可以制备成多种格式和不同百分比。

这种非连续缓冲体系的配方能够产生堆积效应，在电泳开始时形成清晰的蛋白条带。在该体系中，氯离子作为前导离子，而甘氨酸根离子作为后随离子，两者之间形成一个移动边界。Tris缓冲液则提供了常见的阳离子。当蛋白质迁移到分离胶中时，会根据分子大小被分离。Tris-甘氨酸凝胶与Laemmli样品缓冲液配合使用，变性SDS-PAGE则使用Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液。天然PAGE则使用不含变性剂或SDS的天然样品和运行缓冲液。在该体系中，用于运行凝胶的缓冲液（Tris，pH 8.3）的pH值和离子强度不同于浓缩胶（Tris，pH 6.8）和分离胶（Tris，pH 8.8）所用缓冲液。Laemmli体系的高碱性操作pH可能导致条带变形、分辨率降低或出现伪影条带。

使用Laemmli体系的缺点：

• 在分离胶的高pH条件下，聚丙烯酰胺发生水解，导致凝胶的保存期仅为8周
• 由于分离胶的高pH，蛋白质可能发生去氨基化和烷基化等化学修饰
• 含有半胱氨酸的蛋白质中还原型二硫键的再氧化
• 在Laemmli样品缓冲液（pH 5.2）中于100°C加热时，蛋白质的Asp-Pro键断裂

Bis-Tris（双三羟甲基氨基丙烷）

与传统的Tris-甘氨酸凝胶相比，Bis-Tris HCI缓冲凝胶运行时更接近中性pH，因此比Tris-甘氨酸凝胶具有更高的稳定性和更长的货架期（在室温下可达16个月）。中性pH能够减少蛋白质降解，适用于需要高灵敏度的应用，如蛋白质翻译后修饰分析、质谱或测序。

对于Bis-Tris凝胶，氯离子作为前导离子，MES或MOPS作为后导离子。Bis-Tris缓冲液形成共同阳离子。根据Bis-Tris凝胶使用MES还是MOPS变性运行缓冲液，蛋白质迁移模式会有明显不同：MES缓冲液适用于较小的蛋白质，MOPS缓冲液适用于中等大小的蛋白质。

由于离子组成和pH的不同，使用Bis-Tris凝胶获得的凝胶图谱无法与Tris-甘氨酸凝胶获得的图谱进行比较。为防止蛋白质再氧化，Bis-Tris凝胶必须使用如亚硫酸氢钠等替代还原剂。常用于Tris-甘氨酸凝胶的还原剂，如β-巯基乙醇和二硫苏糖醇（DTT），在低pH下不会发生离子化，无法与蛋白质一起在Bis-Tris凝胶中迁移。

Tris-醋酸

Tris-醋酸凝胶化学能够实现高分子量蛋白的最佳分离。Tris-醋酸凝胶采用一种不连续缓冲体系，涉及三种离子——醋酸盐、Tricine和Tris。由于醋酸盐对阳极的亲和力高于体系中的其他阴离子，因此它作为前导离子。Tricine作为拖尾离子。Tris-醋酸凝胶可以与SDS-PAGE和原生PAGE运行缓冲液一起使用。与Tris-甘氨酸凝胶相比，Tris-醋酸凝胶的pH值较低，这增强了凝胶的稳定性并减少了蛋白质修饰，从而产生更清晰的条带。

Tris Tricine

Tris-Tricine凝胶体系是Tris-甘氨酸凝胶体系的改良版，优化用于分离分子量在2–20 kDa范围内的低分子量蛋白。通过重新配制Laemmli运行缓冲液并用Tricine替代甘氨酸，SDS-多肽在前导离子前形成，而不是与SDS前沿一起运行，因此能够将其分离成独立的条带。

Zymogram

Zymogram凝胶是含有明胶或酪蛋白的Tris-甘氨酸凝胶，用于鉴定以这些底物为基质的蛋白酶。样品在变性条件下运行，但由于缺乏还原剂，蛋白质会重新复性。样品中的蛋白水解酶消耗底物，在蓝色染色背景下形成清晰的条带。

选择哪种化学体系取决于分离蛋白的丰度、蛋白的大小以及后续应用。对于分离广泛范围的蛋白，两种化学体系：Bis-Tris和Tris-甘氨酸都非常适合。Bis-Tris凝胶化学相比Tris-甘氨酸凝胶化学具有更高的蛋白检测灵敏度。当蛋白丰度较低或后续应用需要高蛋白完整性（如翻译后修饰分析、质谱或测序）时，建议选择Bis-Tris凝胶化学。

蛋白样品在进行SDS-PAGE分析前，会在含有1% SDS的样品缓冲液中加热变性，缓冲液中可以含有或不含有还原剂，如20mM DTT、2-巯基乙醇（BME）或Tris(2-carboxyethyl)phosphine（TCEP）。蛋白样品与样品缓冲液混合后，根据具体实验方案加热3到5分钟，然后冷却至室温，最后用移液器将其加入凝胶的样品孔中。加载缓冲液还含有甘油，使其比水重，加入凝胶时能顺利沉到缓冲液覆盖的孔底。

如果样品缓冲液中还加入了合适的带负电荷、低分子量染料，该染料会随着缓冲液前沿迁移，从而便于监控电泳进程。最常用的样品加载缓冲液示踪染料包括溴酚蓝、酚红和考马斯蓝。下表总结了不同凝胶缓冲体系中常用的样品缓冲液和运行缓冲液。

传统上，研究人员会使用蛋白质方法文献中广泛提供的标准配方自行浇注凝胶。越来越多的实验室选择使用市售的、即用型预制凝胶，以获得更高的便利性和一致性。预制凝胶有多种百分比可选，包括难以手工浇注的梯度凝胶，这类凝胶能提供出色的分辨率，并能分离范围最广的蛋白分子量。预制凝胶还提供不同的缓冲液配方（如Tris-甘氨酸、Bis-Tris、Tris-乙酸、Tricine），这些配方旨在优化凝胶的保存期、运行时间和/或蛋白分辨率。

对于需要特殊凝胶配方而市售预制凝胶无法满足的研究人员来说，市面上有各种试剂和设备可用于手工浇注凝胶。然而，缓冲液和凝胶聚合技术的创新，使制造商能够生产出比研究人员用传统设备和方法自行制备的凝胶更均匀、保存期更长的产品。此外，预制聚丙烯酰胺凝胶还消除了与丙烯酰胺单体接触的风险，而丙烯酰胺单体已知为神经毒素并被怀疑为致癌物。

预制与手工浇注蛋白凝胶用于SDS-PAGE。聚丙烯酰胺凝胶可以购买预制并可直接使用（左），也可以在实验室通过凝胶浇注系统用试剂自行制备（右）。图中展示的是Novex Tris-Glycine Mini Gels，WedgeWell格式（左）和SureCast Gel手工浇注系统。

为了进行蛋白凝胶电泳，需要将聚丙烯酰胺凝胶和缓冲液放入与电源连接的电泳槽中，该槽设计用于通过缓冲液导电。当电流施加时，较小的分子在凝胶基质中迁移得更快，而较大的分子迁移得更慢。电泳槽有多种设计。设备的选择通常基于以下因素：凝胶盒的尺寸，有些槽设计可容纳更多种尺寸的盒子；蛋白目标的性质及相应的凝胶分辨率要求；以及是否选择预制或手工浇注凝胶，以及垂直或水平电泳系统。

为了评估凝胶中蛋白的分子质量（大小），通常会在凝胶的一条或多条泳道中，与待测样品同时上样一组已知分子量的蛋白混合物。这些已知蛋白的集合被称为蛋白分子量（或质量）标准或蛋白ladder。可以根据每个标记蛋白迁移的距离绘制标准曲线。然后将未知蛋白的迁移距离绘制在曲线上，并根据标准曲线推算其分子量。

有多种即用型蛋白分子量（MW）标准可供选择，这些标记可以是未标记的或预染色的，以适应不同的检测方式。这些标记已预先还原，因此主要适用于SDS-PAGE，而非原生PAGE。MW标记还可以通过特殊标签（如荧光标记）及其他方法实现可检测性。

通常，蛋白质在SDS凝胶中的迁移率取决于其完全变性状态下的长度。通过使用已知分子量的蛋白标准品构建标准曲线，可以根据样品蛋白的相对迁移率计算其分子量。然而，相同的分子量标准品在不同的SDS-PAGE缓冲体系中运行时，迁移率可能略有不同，因此其表观分子量也会有所差异。

在使用SDS-PAGE进行分子量校准时，蛋白质的实际分子量（可通过已知氨基酸序列精确计算）可能会出现轻微偏差，这主要是因为即使在SDS存在的情况下，蛋白质仍然保留了不同程度的二级结构。这种现象在具有高度有序二级结构的蛋白质（如胶原蛋白、组蛋白或高度疏水的膜蛋白）以及肽段中更为常见，因为在肽段中局部二级结构的影响相对于肽段的整体大小被放大了。

还观察到，当相同的蛋白质在不同的SDS-PAGE缓冲体系中运行时，其迁移率会有细微差异。每种SDS-PAGE缓冲体系的pH值不同，这会影响蛋白质的电荷以及其与SDS的结合能力。对于天然蛋白质来说，迁移率的变化通常较小，但对于非典型或经过化学修饰的蛋白质（如预染标准品）则更为明显。预染标准品的表观分子量在不同的凝胶体系中会有所不同——为了对样品蛋白进行最准确的校准，务必使用与您的凝胶体系相匹配的表观分子量。

• Coligan, J.E. 等编辑（2002年）。电泳，载于《当前蛋白质科学实验方案》，第10.0.1-10.4.36页。John Wiley and Sons, Inc. 纽约。
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• Hames, B.D. 和 Rickwood, D. 编辑（1990年）。蛋白质凝胶电泳：实用方法，第2版。牛津大学出版社，纽约。

• 蛋白质凝胶选择指南
• 文章：Western Blot（蛋白质免疫印迹）概述
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