Western Blot常见问题指南

当蛋白条带发散、分辨率低并伴随泳道弯曲或出现纵向条纹时，通常与上样量过高或样品缓冲条件不合适有关。建议减少蛋白上样量。为了获得理想的分辨率，在 10、12、15 或 17 孔的小型胶中，建议的最大样品上样量为每条带 0.5 μg，或者每泳道约 10-15 μg 细胞裂解物。

常见原因是样品中盐浓度过高或存在影响黏度的组分。推荐解决方案：进行透析以降低盐浓度。推荐使用微量透析工具，例如 Thermo Scientific Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，0.5 mL。电泳前，将样品浓缩并重新溶解于低盐缓冲液中。使用小体积的浓缩管，如 Thermo Scientific Pierce PES 蛋白浓缩管，0.5 mL。确保样品中的盐浓度不超过 100 mM。

如果部分泳道异常狭窄且条带形状怪异，常见原因是DNA 污染——细胞裂解液中的基因组 DNA 可能导致样品变粘，导致蛋白质聚集，从而影响蛋白质迁移模式和分辨率。建议上样前先去除基因组 DNA 以降低粘度。

1. 可能原因：样品中盐离子浓度过高（氯化钠）。高盐浓度会导致电导率增加，从而影响蛋白质迁移，并可能导致蛋白质条带扩散到包含正常盐浓度样品的相邻泳道中

   解决方案：进行透析以降低盐浓度。推荐使用微量透析工具，例如 Slide-A-Lyzer MINI 透析装置，0.5 mL电泳前，将样品浓缩并重新溶解于低盐缓冲液中。使用小体积的浓缩管，如 Pierce PES 蛋白浓缩管，0.5 mL。确保样品中盐浓度不超过 100 mM。

2. 可能原因：凝胶电泳中去垢剂浓度过高（例如 SDS 或 Triton X-100）。去垢剂与凝胶中的阴离子去垢剂 SDS 形成混合胶团，并向下迁移到凝胶中；它们会干扰 SDS-蛋白质的结合平衡

   解决方案：大多数非离子型去垢剂（例如 Triton X-100、NP-40 和 Tween 20）会干扰 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。保持 SDS 与非离子型去垢剂的比例在 10：1 或更大，以最小化这些影响。使用去垢剂去除柱或 Thermo Scientific Pierce SDS-PAGE 样品前处理试剂盒去除多余的去垢剂。

3. 可能原因: 高浓度的 RIPA 缓冲液会导致泳道变宽并在电泳过程中出现明显的条纹

   解决方案：电泳前稀释样品，以降低裂解缓冲液的终浓度，防止缓冲液带来的不利影响。

可能原因：裂解液或样品缓冲液中的还原剂过多

解决方案：SDS-PAGE中，还原剂 DTT（二硫苏糖醇）和 TCEP（三（2-羧基乙基）膦）的终浓度应小于 50 mM， β-ME（β-巯基乙醇）还原剂的终浓度应小于 2.5％。

1. 常见原因：抗体浓度过高。

   解决方案：降低抗体浓度，特别是一抗的浓度。

2. 常见原因：凝胶上样量过高

   解决方案：减少凝胶上加入的样品量

3. 常见问题：化学发光底物的信号过强

   解决方案：减少印迹的成像或曝光时间，更换特异性更好的抗体，缩短膜与底物的孵育时间。孵育结束后，完全去除底物。降低抗体浓度，特别是 HRP 或 AP 标记二抗的浓度。

1. 常见原因：抗体浓度过高，导致抗体非特异性结合

   解决方案：降低一抗或二抗的浓度。

2. 常见原因：封闭液选择不当

   解决方案：不要在亲和素-生物素系统中使用牛奶进行封闭。牛奶中含有生物素，这会导致背景过高。在检测磷蛋白时，避免使用磷酸盐缓冲液（如 PBS）和含磷蛋白的封闭剂（如牛奶或酪蛋白）。可以使用含BSA的 Tris 缓冲液封闭。通过封闭一张干净的膜，与抗体孵育后用底物进行检测，来测试封闭液中的交叉反应性。使用碱性磷酸酶（AP）标记物时，应选择 Tris 缓冲体系（TBS）的封闭液，因为磷酸盐缓冲液（PBS）会干扰 AP 的活性。尝试另一种封闭缓冲液。使用我们的 封闭液选择指南，为您的实验查找最适合的封闭液。

3. 常见原因：非特异性位点的不充分封闭

   解决方案：增加封闭液中的蛋白浓度。优化封闭时间和温度。在室温（RT）下封闭至少 1 小时，或在 4°C 下封闭过夜。在封闭液中添加 Tween 20 去垢剂有助于减少背景。但是，过多的去垢剂会干扰抗体结合。通常， 0.05% 的终浓度比较合适。为便于使用，可选择已包含 0.05％ Tween 20 去垢剂的封闭液，例如 Thermo Scientific StartingBlock T20 封闭液（TBS）或（PBS）或 SuperBlock T20 封闭液（TBS）或（PBS）。使用包含 0.05％ Tween 20 去垢剂的封闭液稀释抗体。使用 Thermo Scientific SuperSignal 蛋白印迹增强剂以降低背景并增强对低丰度和弱免疫反应性抗原的检测。

4. 常见原因：漂洗不充分

   解决方案：增加漂洗次数和漂洗缓冲液的体积。将 Tween 20 去垢剂添加到漂洗缓冲液中，终浓度为 0.05％。如果 Tween 20 去垢剂的浓度过高，它会从膜上剥离蛋白质。

5. 常见原因：印迹膜处理不当

   解决方案：根据制造商的说明书润湿并活化膜。处理膜时，请始终戴上干净的手套并使用镊子。始终用液体覆盖膜以防止干燥。在所有孵育过程中都要进行震荡。小心处理膜——损坏膜会引起非特异性结合。

6. 常见原因：设备或材料被污染

   解决方案：在使用之前制备新鲜的缓冲液并过滤。只能使用干净且无污染的电泳设备、印迹设备和培养皿。

7. 常见原因：化学发光底物的信号过强

   解决方案：减少印迹的成像或曝光时间，更换特异性更好的抗体，缩短膜与底物的孵育时间。孵育结束后，完全去除底物。降低抗体浓度，特别是 HRP 或 AP 标记二抗的浓度。

1. 可能原因：转印不完全或不理想

   解决方案：转印后，通过使用总蛋白染料对凝胶染色以评估转印效率。转印后，使用 Thermo Scientific Pierce 可逆蛋白染色试剂盒（ PVDF ）或（ 硝酸纤维素膜 ）将膜染色，以评估转印效率。使用气泡滚轮除去转印三明治中的气泡，确保转印过程中凝胶与膜之间充分接触。确保转印三明治以正确的方向放置在转印设备中，使蛋白质迁移到膜上。根据制造商的说明书润湿并活化膜。使用阳性对照（例如预染蛋白分子量标准）帮助评估转移效率。使用可通过化学发光底物成像的分子量标准，例如 Invitrogen iBright 预染蛋白 Ladder 或者 Invitrogen MagicMark XP Western蛋白Ladder ，作为阳性对照。增加转印时间或电压。确保样品前处理条件没有破坏样品的抗原性。（某些蛋白质不能在还原条件下电泳）。

2. 可能原因：与膜的结合不充分

   解决方案：对于低分子量抗原，可在转印缓冲液中添加 20％ 甲醇以促进结合并防止蛋白质穿过膜。 减少转印时间。低分子量抗原可能会穿过膜。 对于高分子量抗原，向转印缓冲液中添加 0.01–0.05% SDS 以促进蛋白从凝胶转移到膜上。 更换膜的类型（NC 与 PVDF）。 换为孔径较小的膜。

3. 可能原因：抗体浓度过低

   解决方案：增加抗体浓度。抗体对靶蛋白的亲和力可能很差。抗体可能失去活性。进行斑点印迹（dot blot）以确定抗体活性。

4. 可能原因：抗原不足

   解决方案：在凝胶上加入更多蛋白样品。

5. 可能原因：抗原被封闭液掩盖

   解决方案：减少封闭液中的蛋白浓度，尝试另一种封闭液。使用我们的 封闭液选择指南 ，为您的实验查找最适合的封闭液。

6. 可能原因：缓冲液中含叠氮化钠。

   解决方案：叠氮化钠会抑制 HRP。请勿将其与结合 HRP 标记抗体一起使用。

7. 可能原因：化学发光底物的信号太弱

   解决方案：增加膜与底物的孵育时间。增加胶片曝光时间。确保底物没有失效。当你的蛋白样品量非常少，推荐使用 Thermo Scientific SuperSignal West Atto 极敏底物 获得更强的蛋白印迹信号。

8. 可能原因：膜已剥离并重新检测

   解决方案：避免同一张膜的多次重复剥离。缩短在剥离液中的孵育时间，以防止抗原丢失。

9. 可能原因：膜上抗原被消化

   解决方案：封闭物质可能具有蛋白水解活性（例如明胶）

10. 可能原因：印迹长时间保存后蛋白质降解

    解决方案：制备新的印迹。

1. 可能原因：所用抗体对靶蛋白的特异性不强

   解决方案：评估并使用其他一抗。仅使用经过蛋白免疫印迹应用验证*的一抗。

2. 可能原因：样品完整性不足

   解决方案：过热或存在蛋白酶活性引起蛋白样品降解，导致靶蛋白分解且抗体对靶标的识别率低例如，请勿在 SDS 样品缓冲液中煮沸 SDS-PAGE 样品，而应在 70°C 下加热 10 分钟，以避免蛋白水解。

3. 可能原因：多重检测中的抗体交叉反应

   解决方案：选择远亲物种产生的一抗。使用经过高度交叉吸附处理的二抗。减少二抗用量，保持在最佳性能范围内。

4. 可能原因：进行多重检测时，临近通道发生了荧光渗漏（串色导致非预期的条带）

   解决方案：避免同时使用光谱相近的标记物，尤其是在信号非常强的情况下。确保可以通过成像仪检测到您的荧光染料。使用仪器上的自动曝光功能确定每个通道上的最佳曝光时间。

1. 可能原因：抗体对靶蛋白的特异性

   解决方案：增加一抗浓度。确保一抗具有理想的滴度，并且对待检测的抗原具有特异性。对于细胞或组织裂解物中的低丰度靶标，增加一抗的用量或凝胶上的样品量。将孵育时间延长至 4°C 过夜，或室温下 3-6 小时。尝试使用抗体增强剂。

2. 可能原因：抗体失去活性

   解决方案：确保正确储存抗体，检查抗体的失效日期，避免多次重复使用稀释的抗体。

3. 可能原因：成像/曝光时间太短

   解决方案：延长曝光时间。通过 iBright FL1500 成像系统的智能成像功能，轻松获得理想结果。

4. 可能原因：仪器设置不正确

   解决方案：确保为目标荧光基团选择了正确的的激发和发射光范围。

5. 可能原因：去垢剂使用不当

   解决方案：去垢剂太多或去垢剂的性质可能会导致信号降低—减少或去除去垢剂。

6. 可能原因：封闭液可阻断抗原

   解决方案：一些封闭液会过度封闭印迹并影响抗原与抗体的结合，特别是当封闭时间超过 1 小时后。用漂洗缓冲液稀释一抗。尝试其他封闭液。

7. 可能原因：凝胶上的样品量不足

   解决方案：蛋白上样量过高可能会掩盖您的靶蛋白，降低抗体的识别能力。蛋白上样量过低会导致抗原不足。对裂解物或样品进行梯度稀释，以确定最适合的蛋白上样量。

8. 可能原因：蛋白质转印效果不佳或转印后蛋白质损失

   解决方案：检查转印条件，确认蛋白质已转移。检测新的蛋白靶点时可能需要重新优化转印条件。

1. 可能原因：膜污染导致高背景

   解决方案：使用干净的镊子和培养皿或孵育盒来处理膜。确定适合您应用的最佳封闭液——一抗在不同的封闭液中反应会有所不同。像常用动物血清或脱脂牛奶这类封闭液可能导致交叉反应。在封闭步骤中限制去垢剂的使用，因为常用去垢剂可自发荧光，通常会增加非特异性背景。封闭后，可以使用去垢剂。

2. 可能原因：蛋白质分子量标准上样量过高导致假信号

   解决方案：减少蛋白质分子量标准的上样量。

3. 可能原因：漂洗或稀释溶液不合适

   解决方案：使用含有 0.1–0.2％ Tween 20 去垢剂的漂洗缓冲液。用 0.05％ Tween 20 去垢剂制备二抗稀释液。增加漂洗的次数或漂洗时间。

4. 可能原因：二抗浓度过高导致高背景

   解决方案：根据所使用的染料优化二抗稀释度，并遵循供应商建议的稀释度进行相应调整。

5. 可能原因：膜干燥导致背景斑点或不均匀

   解决方案：在所有孵育步骤中，确保液体充分覆盖整个印迹。每个孵育步骤中，确保震荡均匀。

6. 可能原因：膜选择不当

   解决方案：膜的性质可影响背景；例如，PVDF 膜可自发荧光并导致高背景，因此，应使用低荧光 PVDF 膜。

7. 可能原因：印迹膜上有灰尘或指印

   解决方案：使用干净的镊子进行处理，并避免用手直接接触膜；不清洁工具带来的微粒和污染物可能产生荧光。

   使用干净的孵育托盘或培养皿——先用甲醇冲洗，再用水冲洗，将有助于溶解并去除残留染料。

   如果使用湿转方法，需要清洁转印装置和沾满灰尘的耗材，避免因此产生斑点。

   进行印迹成像之前，用乙醇擦拭成像系统的托盘表面，去除灰尘、棉绒和残留物。