球状体生成前 T47D 细胞的维持培养

从液氮中解冻后，将细胞维持培养在 Nunclon Delta T25 细胞培养瓶内添加了 10% Gibco FBS 和 1% Pen-Strep 的 Gibco RPMI 培养基中，经1次传代后接种用于生成球状体。然后遵循 ATCC 实验方案进行传代培养。

所需材料

球状体生成实验方案

  1. 在实验当天，从培养瓶中吸出培养基，在 1X PBS 中洗涤细胞一次，然后用 1–1.5 ml TrypLE 试剂解离。
  2. 使用4倍体积的完全培养基中和 TrypLE 试剂，并使用 Countess II 细胞计数舱室采集活细胞计数和活力。采集活力达到 >90% 的细胞用于生成球状体。
  3. 在完全培养基中对细胞储备液进行 1:10 至 1:20 稀释，以更容易计算细胞接种密度。
  4. 使用细胞接种计算器计算接种细胞数。
  5. 使用多通道移液器将所需数量的细胞接种到 Nunclon Sphera 微孔板各自的孔中。最终体积保持在 200 μl。
  6. 将微孔板以 250 g 的设置离心5分钟，然后置于培养箱中。此为第0天。
  7. 每隔一天按 1:1 的比例更换培养基。（吸出 100 μl 用后培养基，加入 100 μl 新鲜培养基）。更换培养基后，将微孔板以 250 g 的设置离心5分钟，然后放回培养箱中。
  8. 球状体在第 4–7 天准备就绪，具体取决于接种数量。

跳转至细胞活力检测实验方案或 LIVE/DEAD 可视化实验方案

Cell Seeding Calculator

Number of live cells/mL
(as determined by the Countess Automated Cell Counter)

Number of cells to seed per well
(user-specified number)

... µL

Volume of cell suspension that contains
the specified number of cells

提示

  • 用 PBS 填充微孔板最外侧的孔，防止孵育过程中培养基蒸发。
  • 对于 T47D 细胞，>8,000 个细胞的接种密度不会形成良好的球状体。
  • 我们发现接种细胞后离心微孔板有助于细胞聚集，从而形成均匀的球状体。但是，此步骤并非必需步骤。

T47D 球状体的形态

Microscopic image of multiple T47D spheroids growing in culture and at different seeding densities

接种 500–10,000 个 T47D 细胞用于生成球状体，并在第2天、第4天和第7天使用 EVOS XL 显微镜在4倍放大倍率下采集球状体的明场图像。比例尺为 200 μm。

T47D 球状体的表征

使用 PrestoBlue HS 细胞活力检测试剂评估细胞活力

  1. 遵循上述球状体生成实验方案来生成球状体。第6天，使用 PrestoBlue HS 细胞活力检测试剂进行细胞活力检测。
  2. 将 PrestoBlue HS 试剂加热至室温。然后，使用多通道移液器将 20 μl 试剂添加到含有 200 μl 培养基的每个孔中，并通过 2–3 次移液轻轻混合。使用仅含新鲜培养基和试剂的孔作为归一化对照（空白）。
  3. 将微孔板在 37°C 下孵育6小时。
  4. 孵育后，以 250 g 的设置将微孔板离心5分钟，并使用具有以下设置的 Varioskan LUX 多功能酶标仪读取荧光值：
    • 激发波长：560 nm；发射波长：590 nm
    • 12 nm 激发带宽
    • 测量时间：100 ms
    • 底部光学读数
    • 在多点读数中“圈出”选择
    • 仪器温度：37°C

将数据导出至 Microsoft Excel 进行分析。按空白对照值对各荧光值进行归一化，并使用绘图和统计软件绘制每个细胞接种数至少6份重复样本的平均值。该实验重复3次。

line graph showing PrestoBlue HS fluorescence as a function of the number of cells seeded per well

细胞接种后第6天 T47D 球状体的相对活力。误差线代表 SEM。

使用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒显现活细胞和死细胞

  1. 使用 LIVE/DEAD 活力/细胞毒性检测试剂盒进行染色，以显现第6天 T47D 球状体中的活细胞和死细胞群。
  2. 在新鲜培养基中加入最终浓度均为 4 μM 的钙黄绿素 AM 和 EthD-1，制得工作溶液（参见应用文档了解关于球状体荧光染色的更多信息）。
  3. 向工作溶液中添加 NucBlue Live ReadyProbes 试剂（2滴/ml），用于球状体核染色。将用后的球状体培养基以 1:1 的比例更换为工作溶液，然后在 37°C 下孵育2小时。
  4. 之后，使用 PBS + 5% FBS（1:1 更换）洗涤一次，最后重悬于 PBS + 0.5% FBS 中（1:1 更换，每次在室温下以 250 g 的设置离心微孔板5分钟，以沉淀球状体），以在荧光成像过程中尽量减弱背景。
  5. 使用 Varioskan LUX 多功能酶标仪采集球状体的荧光读数（EthD-1 的 Ex/Em 为 530+12/645+12 nm），然后使用 CellInsight CX7 高内涵筛选平台在 4X 物镜下进行球状体成像。每幅图像的最大强度投影为12 μM z 轴层扫（500–1,000 个细胞时为18-20，2,000–4,000 个细胞时为 25-30，6,000-8,000 个细胞时为 30–35）。

备注：随着球状体直径增大，染料渗透率下降，并且死细胞群扩大（红色染色）。

microscopic views of fluorescently stained spheroids

显示活细胞（绿色染色）和死细胞（红色染色）群的第6天 T47D 球状体的代表性图像（上方图像）。下方图像显示核染色。比例尺 = 200 μM。对细胞核进行伪彩色处理，以获得更好的可见性。

bar chart showing the percent dead cells for each seeded cell sample

第6天 T47D 球状体内的死细胞百分比。使用 Varioskan LUX 多功能酶标仪采集荧光读数，并在 Microsoft Excel 中进行分析。使用经过 70% 甲醇整夜处理的球状体作为各自接种密度下的死细胞阳性对照。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。