解冻细胞 | Thermo Fisher Scientific

在传代贴壁或悬浮细胞后，您可能需要将不用于即时实验的细胞冷冻保存。本细胞冻存方案列出了在开始冻存前需要准备的事项和应订购的材料。还提供了可在操作中参考或日后查阅的分步操作说明。

内容目录：

视频: 细胞冻存
细胞冻存所需材料
细胞冷冻培养基
如何冻存细胞

细胞低温保存（或称细胞冻存）是一种在极低温度下保存活细胞和组织以长期维持其结构的技术。将温度降至低于 −130°C 时，细胞外会形成冰晶，降低细胞内的动力学和分子活动，从而减缓生物学老化过程。

为什么要冻存细胞？

冻存细胞对于维持充足的细胞库存至关重要
细胞系是宝贵资源，替换成本高且耗时
对有限代细胞系进行冻存可防止衰老和转化
对持续培养的细胞进行冷冻可防止：
- 遗传漂移
- 细胞衰老
- 微生物污染
- 设备故障

当从传代培养中获得少量过剩细胞时，一种高效的方法是将其冷冻保存为种子库，以便保护并避免用于常规实验室用途。可以从这些冷冻的种子库制备并补充工作库。如果种子库耗尽，冷冻保存的工作库可用来制备新的种子库，并且相比最初冷冻，代次增加非常有限。下列材料与细胞冷冻流程将帮助您保存过剩细胞，以备将来用作工作库或种子库。

视频：细胞冻存

本视频展示在维持细胞最佳活性下冷冻细胞的关键步骤。我们介绍所需设备、准备步骤，以及以正确节奏细致执行的每一步，以防止细胞损伤。

细胞冷冻所需材料

我们建议在细胞冻存操作中使用以下材料：

对数生长期培养的细胞
完全培养基：基础培养基、血清、补充剂，并预温至 37°C
防冻剂，例如 DMSO（为细胞培养预留专用瓶；仅在生物安全柜/层流罩内开启）或冻存培养基，例如 Synth-a-Freeze Cryopreservation Medium 或 Recovery Cell Culture Freezing Medium
一次性、无菌15 mL 或 50 mL 锥形离心管
用于测定可存活细胞数和总细胞数的试剂与设备（例如：Trypan Blue、血球计数板或细胞计数器，例如 Countess Automated Cell Counter），以及
无菌冻存管（即冻存管）
控速降温冻存装置或异丙醇冷冻盒
液氮储存容器

对于贴壁细胞冻存，除上述材料外，还需准备：

平衡盐溶液（例如 DPBS），Gibco Dulbecco 磷酸盐缓冲液，不含钙、镁或酚红
解离试剂，胰蛋白酶 Gibco TrypLE Express，例如或，不含酚红

细胞冷冻培养基

抗冻保护剂可降低培养基的冰点并减缓冷却速率，从而大幅降低冰晶形成的风险；冰晶会损伤细胞并导致细胞死亡。冷冻保存用培养基通常包括基础培养基、抗冻保护剂和蛋白质来源，但建议您严格遵循所用细胞株及产品的具体说明，以确定最适合您实验的冷冻保存培养基。抗冻保护剂和蛋白质可在冷冻—解冻过程中保护细胞，减轻应激损伤。随后将细胞在液氮中冷冻保存。

前往冷冻保存培养基选择指南

含血清培养基的成分可能为：

含 10% 甘油的完全培养基
complete medium containing 10% DMSO（二甲基亚砜）
50% 细胞条件化培养基 + 50% 含 10% 甘油或 10% DMSO 的新鲜培养基

注意：已知 DMSO 溶液会促进有机分子进入组织的过程。处理含 DMSO 的试剂时，应始终使用与其危险性相适应的设备和操作规程，并按当地法规处置该类试剂。

无血清培养基通常蛋白含量很低或不含蛋白；但仍可将其作为冻存保护液的基础，按以下配方使用：

50% 细胞条件化无血清培养基 + 50% 含 7.5% DMSO 的新鲜无血清培养基
含 7.5% DMSO 和 10% 细胞培养级 BSA 的新鲜无血清培养基

您也可以使用以下专门配方的完全冻存培养基：

50 mL bottle of Recovery Cell Culture Freezing Medium

Gibco Recovery Cell Culture Freezing这是一种即用型的完整冻存培养基，适用于哺乳动物细胞培养。其胎牛血清与牛血清的比例经优化，可提高解冻后细胞的存活率和恢复能力。

50 mL bottle of Gibco Synth-a-freeze freezing medium

Gibco Synth‑a‑Freeze 冷冻保存培养基这是一种化学定义、无蛋白、无菌的冻存培养基，含10% DMSO，适用于多种干细胞和原代细胞类型的冻存（黑色素细胞除外）。

如何冻存细胞

正确的无菌操作技术 - 正确地冻存细胞并保存细胞系以备将来使用，需认真注意传代操作和储存要求。在冻存细胞时务必佩戴个人防护装备并采用适当的无菌操作。

悬浮细胞和贴壁细胞的冻存方法总体相同，但贴壁细胞需在开始冻存程序前从培养皿上移离。下面的细胞冻存方案为一种通用流程，用于培养细胞的冻存。最佳冻存条件依所用细胞系而异——有关详细步骤，请始终参阅该细胞对应的产品说明书。

在冻存前，应对细胞进行鉴定并检查是否受污染。在对数生长期、细胞活力至少达到90%且传代数尽可能低的条件下冻存，这样在复苏时通常能获得最佳效果。
准备冷冻培养基（配制冻存培养基并于 2°C–8°C 保存），并在2°C至8°C条件下保存，直至使用。
按传代操作程序 - 对于贴壁细胞，轻柔地将细胞从培养容器中脱离。尽可能温和操作，以将细胞损伤降到最低。
将脱离下来的细胞重悬于完全培养基中。
使用血球计数板或 Countess 自动细胞计数仪并结合 Trypan Blue 排除法排除法来测定细胞总数和存活率。.
根据所需的存活细胞密度，计算所需的冻存培养基体积。
以约 100–400 × g 离心细胞悬液 5–10 分钟（离心速度和时间取决于细胞类型）。使用移液器在不扰动细胞沉淀的情况下无菌地尽量吸去上清至最小体积并弃掉。
将细胞沉淀重悬于冷冻/冻存培养基中，按该细胞类型推荐的存活细胞密度配置。
将细胞悬液分装到无菌低温保存管中。分装过程中要轻柔并频繁混匀，以保持细胞悬液均匀。
以每分钟约 1°C 的速度缓慢降温冻存细胞，使用受控速率冷冻仪或像 “Mr. Frosty,” 这样的冻存容器（由 Thermo Scientific Nalgene 实验器具供应，Nalgene Nunc）。或者，将装有细胞的冻存管放入异丙醇冷却盒中，在 –80°C 下过夜保存。
将冻存细胞转移至液氮，并在液氮上方的气相（低于 –135°C）中保存。

下一篇实验方案:

细胞复苏

细胞冻存方案

为什么要冻存细胞？

视频：细胞冻存

细胞冷冻所需材料

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