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在一种技术不能完全胜任时完整、准确地测定 3D 结构

为了解蛋白质在细胞环境中的功能,必须确定蛋白质复合物的组成和结构,而不仅仅是单个蛋白质。若要解析大型动态复合物的结构,通常需要综合运用多种互补技术,如生物大分子质谱 (MS) 和冷冻电子显微技术(冷冻电镜),这种方法称为整合结构生物学。

通过提高速度、灵敏度、选择性以及多种质谱裂解技术,质谱在结构生物学领域取得了重大进展。同样,冷冻电镜样品制备、显微镜和检测器技术、数据收集自动化和图像处理方面的最新发展也使得可重复达到近原子分辨率成为可能。综合运用这些技术,可以解析由蛋白质、翻译后蛋白质修饰、DNA、RNA 和脂质等成分组成的大分子复合物的可靠、完整的结构。

整合结构生物学流程(包括质谱和冷冻电镜数据)
整合结构生物学流程的示意图,包括质谱和冷冻电镜数据。
电子显微镜

整合结构生物学

利用质谱和冷冻电镜技术测定 3D 结构。


整合结构生物学工作流程

天然MS揭示蛋白复合物和复合物亚基
天然 MS 可以揭示完整的复合物是否与蛋白质亚基的质量相匹配、是否可以低聚物的形式存在、某个亚基是否存在多个副本或者小分子是否可能与复合物结合。

样品筛选和优化

可能产生高分辨率冷冻电镜结构的样品必须由完整、稳定且成分均一的生物分子组成。天然 MS 能够快速、轻松且定量地检查这些参数。

结构组分的鉴定

质谱仪可以通过变性质谱法分析蛋白质复合物的亚基组成,并揭示细胞环境中的相互作用对(相互作用组学)以及亚基单位化学计量。该信息给出了结构同源性,有助于后续解析和建模。

 

显示折叠、变性和错误折叠蛋白质的天然质谱。天然质谱分析法可以快速准确地读出蛋白质的完整性和稳定性。图中所示为相同蛋白质的三种制备:正确折叠的天然状态(顶部)、在制备过程中变性(中间)和错误折叠(底部)。这种状态与蛋白质复合物在电离过程中获得的电荷数直接相关。

可调节蓝藻生物钟的 KaiCBA 蛋白复合物的冷冻电镜结构。

冷冻电子显微成像

冷冻电镜,尤其是单颗粒分析 (SPA),正在成为必不可少的病毒和蛋白质复合物结构测定技术。利用 SPA,可以对各个随机定向的病毒/蛋白质复合物的 2D 透射电子显微照片进行计算和数据重构,生成 3D 标本体积。这使得冷冻电镜成为传统技术(如 X 射线晶体学和核磁共振 [NMR])的替代方法,它甚至可以显示完整的大分子复合物,而不仅仅是选定部分。

构建 3D 模型

在化学交联之后进行质谱分析,可提供有关大型复合物中整体蛋白质亚基拓扑结构的信息。这种拓扑结构有助于在大型冷冻电镜密度图中定位亚基。除了整体亚基拓扑结构,当与氨基酸序列结合时,相同的交联还可以在电镜密度图中从头建立原子模型。最后,在交联空间约束的作用下,原子模型得以验证和完善。

利用冷冻电子显微镜获得的 28S 亚基蛋白质结构。28S 亚基的蛋白质。用 CX-MS 交联法鉴定了线粒体特异性核糖体蛋白并确认了其位置(交联残基的 Cα 显示为球面)。
使用冷冻电子显微镜获得的 KaiCBA 蛋白复合物图像。进行天然 MS 筛选以获得最佳样品条件后通过冷冻电子显微术在 4.7 Å 分辨率下获得的 KaiCBA 生物钟蛋白复合物的结构。

RNA, 转译后修饰和脂质

为了进一步完善并获得完整的原子模型,质谱可以定位大分子复合物中的柔性域和弱密度。转译后修饰、结构脂质和核糖核酸(如 RNA 和 DNA)都可以被鉴别和定位,有助于对电镜密度图的不明确区域进行建模。

对来自不同来源和方法的信息进行整合后,原子模型的可靠性将大大增强。随着 MS 和冷冻电镜的不断进步,以及这些协同方法的进一步应用,整合结构生物学将继续产生可靠性、完整性和精度出色的 3D 结构。


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应用

使用冷冻电镜进行结构生物学研究

结构生物学研究

借助冷冻电镜(Cryo-EM)对具有挑战性的生物靶标(例如大型复合物、柔性物质和膜蛋白)进行结构分析。

使用冷冻电镜进行药物发现研究

药物发现

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样品


蛋白质结构分析

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产品

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Glacios 冷冻 TEM

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Tundra Cryo-TEM

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Talos Arctica TEM

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Talos F200C TEM

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Aquilos 2 Cryo-FIB

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Vitrobot 系统

  • 全自动样品玻璃化
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  • 高样品通量

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Falcon 4i 直接电子检测相机

  • 高吞吐量,每小时可获得更多图像
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Tomography 5
软件

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  • 可达到最佳电子剂量的剂量对称倾斜方案
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  • 关联不同来源的数据

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  • DualBeam 自动连续切片
  • 多模式数据采集(SEM、EDS、EBSD)
  • 实时编辑功能
  • 基于边缘的剪切放置

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  • 用于交叉关联的图像处理工具和过滤器
  • 用于图像对齐的特征跟踪
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生命科学

  • 探索 2D-5D 生物成像数据
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EPU 2 软件

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