介绍

酶联免疫吸附测定（ELISA）是一种基于微孔板的检测方法，用于检测和定量复杂混合物中特定蛋白质。在夹心ELISA中，高特异性的抗体将目标蛋白（抗原）固定在板上，并间接检测目标蛋白的存在。这种捕获实验被称为夹心实验，是因为分析物被夹在两种主要抗体之间，每种抗体识别抗原的不同表位——即捕获抗体和检测抗体。

以下为标准夹心ELISA的实验方案，使用96孔板进行比色（显色）、化学发光和荧光检测技术。

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ELISA方法概述

  1. 将针对目标蛋白的捕获抗体结合到微孔板上
  2. 加入含有未知量目标蛋白的标准品和样品，目标蛋白可与包被抗体结合
  3. 洗涤以去除未结合的物质
  4. 加入可与固相化目标蛋白结合的检测抗体
  5. 洗去多余的检测抗体并加入辣根过氧化物酶（HRP）结合物
  6. 加入HRP底物以间接检测结合的蛋白
比色法夹心ELISA操作流程

本操作流程为比色法夹心ELISA的示例，既可采用HRP标记抗体进行直接检测，也可采用生物素化抗体和链霉亲和素-HRP进行间接检测。

材料


还需准备的其他材料


操作步骤

  1. 通过将捕获抗体稀释在包被缓冲液中，制备包被液。稀释建议请参考下方抗体稀释建议表或生产商说明书。
  1. 每孔加入100 µL包被液进行包被。盖好板子并在室温下孵育1小时，或在2–8°C下过夜孵育（12–18小时）。
  1. 吸取孔内液体后，每孔用>300 µL 洗涤缓冲液洗涤一次。洗涤后，将板子倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。
  1. 每孔加入300 µL封闭缓冲液进行封闭，在室温下孵育1小时。
  1. 吸取封闭缓冲液后，将板子倒置，并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。
  1. 在封闭缓冲液中准备标准品和样品稀释液。
  1. 吸取100 µL标准品（每个标准品做两份）和样品，加入指定孔中。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm），孵育1–2小时。
  1. 吸取孔内液体，并用每孔>300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。
  1. 通过将检测抗体稀释在封闭缓冲液中，制备检测抗体溶液。关于推荐的抗体稀释比例，请参考生产商说明。
  1. 向每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm），孵育2小时。
  1. 吸取孔内液体，并用每孔>300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。如果检测抗体为HRP偶联，则直接进行第15步。
  1. 如果检测抗体为生物素标记：在封闭缓冲液中以1:5,000的比例配制链霉亲和素-HRP工作液。例如，若需一块板的用量，加入2 µL链霉亲和素-HRP至9.998 mL封闭缓冲液中。
  1. 如果检测抗体为生物素标记：向每个孔中加入100 µL链霉亲和素-HRP工作液。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm），孵育1小时。
  1. 如果检测抗体是生物素化的： 吸取孔内液体，并用每孔超过300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。
  1. 向每个孔中加入100 µL的TMB底物溶液。在室温下孵育30分钟，或直到达到所需的颜色强度。
  1. 向每个孔中加入100 µL的终止液。
  1. 在加入终止液后30分钟内，于450 nm处测量吸光度。
  1. 使用对数-对数或四参数曲线拟合计算结果。

使用碱性磷酸酶系统

如果使用碱性磷酸酶（AP）代替HRP作为酶偶联物，则必须使用AP专用底物。在第15步中用对硝基苯磷酸（PNPP）替代TMB底物溶液。在室温下孵育15–30分钟。用50 µL的2 N NaOH替代终止液以终止反应。于405 nm处测量每个孔的吸光度。

直接抗原固定

当将含抗原的样品直接固定到板上时，无需使用捕获抗体。应将不同浓度的样品用包被缓冲液配制，并将相同体积直接加入到板中。其余步骤按照之前描述的方法进行，使用检测抗体和酶偶联物以及底物。

使用酶标记的二抗

当使用非生物素化检测抗体，随后加入酶标记的二抗时，酶信号的放大效果会略低于使用生物素化检测抗体与链霉亲和素-HRP的情况。因此，可能需要使用比链霉亲和素-酶偶联物稍高浓度的二抗-酶偶联物。

化学发光夹心ELISA实验方案

本方案展示了化学发光夹心ELISA的一个示例，可采用HRP偶联抗体进行直接检测，或使用生物素化抗体与链霉亲和素-HRP进行间接检测。检测时使用以鲁米诺为基础的底物。

材料

还需准备的其他材料

操作流程提示

在检测和定量低丰度蛋白或样品及一抗（捕获和检测抗体）有限时，建议使用化学发光法进行检测。

操作流程提示

化学发光检测可以使用白色或黑色微孔板。白色微孔板通常信号更高，而当背景信号较大时应使用黑色微孔板。

操作步骤

  1. 通过将捕获抗体稀释在包被缓冲液中，制备包被液。稀释建议请参考下方抗体稀释建议表或生产商说明书。
  1. 每孔加入100 µL包被液进行包被。盖好板子并在室温下孵育1小时，或在2–8°C下过夜孵育（12–18小时）。
  1. 吸取孔内液体后，每孔用>300 µL洗涤缓冲液洗涤一次。洗涤后，将板子倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。
  1. 每孔加入300 µL封闭缓冲液进行封闭，在室温下孵育1小时。
  1. 吸取封闭缓冲液后，将板子倒置，并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。
  1. 在封闭缓冲液中准备标准品和样品稀释液。
  1. 吸取100 µL标准品（每个标准品做两份）和样品，加入指定孔中。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm），孵育1–2小时。
  1. 吸取孔内液体，并用每孔>300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。
  1. 通过将检测抗体稀释在封闭缓冲液中，制备检测抗体溶液。关于推荐的抗体稀释比例，请参考生产商说明。
  1. 向每个孔中加入100 µL检测抗体溶液。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm），孵育2小时。
  1. 吸取孔内液体，并用每孔>300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。如果检测抗体为HRP偶联，则直接进行第15步。
  1. 如果检测抗体为生物素标记：在封闭缓冲液中按1:5,000—1:20,000的比例配制链霉亲和素-HRP的工作液。例如，若需配制一块板的用量，则向9.998 mL的封闭缓冲液中加入2 µL链霉亲和素-HRP。最佳稀释比例需通过实验确定。
  1. 如果检测抗体是生物素化的：向每个孔中加入100 µL工作浓度的链霉亲和素-HRP溶液。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm）孵育1小时。
  1. 如果检测抗体是生物素化的：吸取孔内液体，并用每孔超过300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。
  1. 通过等量混合Luminol和稳定过氧化物溶液，配制化学发光底物工作液。
  1. 向每个孔中加入100 µL工作浓度的化学发光底物溶液。在室温下孵育1分钟。
  1. 在加入底物后1–5分钟内，使用发光仪测量相对光单位（约425 nm）。底物加入与板测量之间的时间越长，信号强度可能会降低。

使用碱性磷酸酶（AP）系统

在将辣根过氧化物酶（HRP）替换为碱性磷酸酶（AP）作为酶结合物时，必须使用AP专用底物。在第15步中，将TMB底物溶液替换为对硝基苯基磷酸酯（PNPP）。将反应混合物在室温下孵育15至30分钟。为终止反应，加入50 µL的2 N NaOH作为终止液。随后，在405 nm处测量每个孔的吸光度。

进行直接抗原包被

当将含抗原的样品直接包被到板上时，不需要捕获抗体。将样品用包被缓冲液配制成不同浓度，并将等体积样品直接加入板中。其余步骤按照之前描述的方案进行，使用检测抗体以及酶结合物和底物。

使用酶标记的二抗

当使用非生物素化的检测抗体，随后加入酶标记的二抗时，与使用生物素化检测抗体和链霉亲和素-HRP相比，酶信号的放大效果会有所降低。因此，可能需要使用比常规链霉亲和素-酶结合物略高浓度的二抗-酶结合物。

荧光夹心ELISA操作流程

本操作流程为荧光夹心ELISA的示例，可采用HRP标记抗体直接检测，或采用生物素化抗体和链霉亲和素-HRP间接检测。检测时使用荧光过氧化物酶底物。

材料

还需准备的其他材料

操作步骤

  1. 通过将捕获抗体稀释在包被缓冲液中，配制浓度为5–10 μg/mL的包被液。
  1. 每孔加入50–100 µL包被液进行包被。盖好板子，并在室温下孵育1小时，或在2–8°C下过夜孵育（12–18小时）。
  1. 吸去孔内液体，每孔用>300 µL的洗涤缓冲液洗涤一次。洗涤后，将板子倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。
  1. 每孔加入300 µL封闭缓冲液进行封闭，在室温下孵育1小时。
  1. 吸去封闭缓冲液，将板子倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。
  1. 在封闭缓冲液中准备标准品和样品稀释液。
  1. 吸取100 µL标准品（每个标准品做两份）和样品，加入指定孔中。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm），孵育1–2小时。
  1. 吸取孔内液体，并用每孔>300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。
  1. 通过将检测抗体稀释至0.05–0.1 μg/mL于洗涤缓冲液中，配制检测抗体溶液。
  1. 每孔加入100 µL检测抗体溶液。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm）孵育1–2小时。
  1. 吸取孔内液体，并用每孔>300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。如果检测抗体为HRP偶联，则直接进行第15步。
  1. 如果检测抗体为生物素标记：将链霉亲和素-HRP稀释至0.05–0.1 μg/mL于洗涤缓冲液中，配制工作液。
  1. 如果检测抗体为生物素标记：每孔加入50–100 µL链霉亲和素-HRP工作液。在室温下轻柔持续摇晃（约500 rpm）孵育1小时。
  1. 如果检测抗体是生物素化的：吸取孔内液体，并用每孔超过300 µL的洗涤缓冲液进行洗涤。洗涤后，将板倒置并在吸水纸上轻拍以去除多余液体。重复洗涤步骤五次。
  1. 配制QuantaBlu底物工作液：将九份QuantaBlu底物溶液与一份QuantaBlu过氧化物溶液混合。
  1. 向每个孔中加入100 µL的工作用QuantaBlu溶液。在室温或37°C下孵育1.5–90分钟。
  1. 加入100 μL的QuantaBlu终止液；酶活性会立即被终止（无需孵育）。
  1. 避免产生气泡。检测溶液中的气泡会导致光散射和错误信号。可将微孔板短暂离心，或用移液器枪头刺破较大的气泡。
  1. 测量相对荧光单位（RFU）。QuantaBlu底物的激发和发射峰值分别为325 nm和420 nm。也可以使用315 nm至340 nm的激发波长和370 nm至470 nm的发射波长进行检测。

使用荧光团标记的检测抗体

使用荧光团标记的检测抗体时，无需酶结合物或底物。在第11步后即可直接测量板上的荧光单位。标记抗体或蛋白的工作浓度通常为2–4 μg/mL。

执行直接抗原固定

对于将含抗原的样品直接固定到板上的方法，不需要捕获抗体。使用包被缓冲液将样品制备成不同浓度，并将等体积样品直接分配到板上。随后按照之前详细说明的步骤继续操作，加入检测抗体以及酶标结合物和底物。

使用酶标记的二抗

当使用非生物素化检测抗体，随后加入酶标记的二抗时，酶信号的放大效果会低于使用生物素化检测抗体与链霉亲和素-HRP的情况。因此，您可能需要将二抗-酶结合物的浓度略微提高，超过通常用于链霉亲和素-酶结合物的用量。

抗体稀释

抗体稀释建议

下表提供了不同ELISA组分的推荐浓度范围。浓度仅供参考；为获得最佳结果，请分别优化每个组分。

ELISA优化时包被抗体和检测抗体的推荐起始浓度范围。使用未纯化抗体也可以，但可能导致较高的背景。通常建议使用亲和纯化抗体，以获得最佳的信噪比。

来源包被抗体检测抗体
多克隆血清5–15 μg/mL1–10 μg/mL
粗制腹水5–15 μg/mL1–10 μg/mL
亲和纯化多克隆抗体1–12 μg/mL0.5–5 μg/mL
亲和纯化单克隆抗体1–12 μg/mL0.5–5 μg/mL

 

不同系统中ELISA推荐的检测抗体浓度。请查阅底物的用户指南，因为其中可能会推荐针对酶偶联物更明确的浓度范围。

酶系统浓度
HRP比色法20–200 ng/mL
化学荧光法25–50 ng/mL
化学发光法10–100 ng/mL
AP比色法100–200 ng/mL
化学发光法40–200 ng/mL

使用酶标记的二抗

当使用非生物素化的检测抗体并在其后加入酶标记的二抗时，所产生的酶信号放大效果相比于使用生物素化检测抗体与链霉亲和素-HRP的方式略有降低。因此，可能需要使用比常规链霉亲和素-酶偶联物更高浓度的二抗-酶偶联物。

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如需完整的ELISA试剂套装，Invitrogen ELISA缓冲液试剂盒包含2种包被缓冲液（pH 7.4和pH 9.4）、5倍浓缩检测缓冲液（封闭试剂和稀释剂）、25倍浓缩洗涤缓冲液、稳定型TMB和终止液。可将此试剂盒与含有配对抗体、标准品和链霉亲和素-HRP偶联物的配对抗体试剂盒搭配使用。

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