本文要点：

  • 本方案用于从小鼠胚胎干细胞（mESC）形成拟胚体（EB），以评估细胞分化潜能。页面介绍中明确说明，EB 可用于测试细胞的分化潜能。
  • EB 通过将 mESC 铺于未经组织培养处理的培养皿中、避免贴壁后形成。页面介绍部分已明确说明这一点。
  • 100 mL mESC EB 完全培养基配方为：KnockOut™ DMEM 83 mL、KSR 15 mL、MEM 非必需氨基酸 1 mL、GlutaMAX™-I 1 mL。
  • 页面还提供了第二种培养基：在 mESC EB 完全培养基基础上加入 10 mL FBS，配制成 100 mL 含 10% FBS 的 mESC EB 培养基。
  • 页面包含完整 workflow：材料准备、培养基配制、AF 包被、mESC 形成 EB，以及后续免疫细胞化学检测。

protocol

介绍

小鼠胚胎干细胞 (mESC) 是来源于囊胚（早期胚胎）内细胞团的多能干细胞1,2。胚胎干细胞不同于其他细胞的两个独特特性是其具有多能性及其在特定条件下自我更新的能力。它们具有多能性，能够分化成初级胚层的所有衍生物，包括外胚层、内胚层和中胚层，从而生成机体的各种细胞类型。mESC 还可以在具有完整胚胎的嵌合体中分化成各种成体组织，包括生殖细胞。

通过将 mESC 铺于未经组织培养处理的培养皿中以防止贴壁，正常传代后生成拟胚体 (EB)。EB 可用于测试细胞的分化潜能。

需要的材料

制备培养基与材料

小鼠胚胎干细胞 (mESC) EB 培养基（100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL mESC EB 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分 用量
    KnockOut™ DMEM83 mL
    KnockOut™ 血清替代物 (KSR)15 mL
    MEM 非必需氨基酸溶液，10 mM1 mL
    GlutaMAX™-I1 mL
  2. mESC EB 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长1周。

含 10% FBS 的小鼠胚胎干细胞 (mESC) EB 培养基（100 mL 完全培养基）

  1. 要制备 100 mL 含 10 % FBS 的 mESC EB 完全培养基，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分 用量
    mESC EB 培养基90 mL
    FBS10 mL
  2. 含 10% FBS 的 mESC EB 完全培养基可在 2–8°C 条件下储存最长1周。

制备 AF 包被培养皿

在 EB 培养第4天时需要使用附着因子 (AF) 培养皿。为您计划生成的每份 mESC EB 样品制备一个 AF 包被培养板。

  1. 用附着因子 (AF) 溶液覆盖 100 mm 经组织培养处理的培养皿的整个表面，并将容器在 37°C 下孵育30分钟或在室温下孵育2小时。
  2. 在层流培养罩中采用无菌操作，临用前通过抽吸完全去除培养容器中的 AF 溶液。包被容器可立即使用或在室温下储存不超过24小时。
    注：在加入细胞或培养基之前，无需洗涤培养表面。

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将 mESC 传代至 EB

  1. 将 mESC EB 培养基和不含钙、镁离子的 Dulbecco’s PBS (DPBS) 以及 StemPro Accutase 溶液预热至 37°C。
  2. 将 EB 加入 100 mm 经组织培养处理的培养皿（即贴壁培养皿）中，以将 mESC 与 MEF 饲养层细胞分离。向每个培养皿中加入 10 mL mESC EB 培养基，制备培养皿。
  3. 从含有 mESC 的培养皿中吸出用过的培养基，并用 DPBS 冲洗一次培养皿（例如，6孔板的每个孔用 2 mL 冲洗）。
  4. 吸出 DPBS，将 StemPro Accutase 溶液加入含 mESC 细胞的培养皿中。根据不同的培养皿尺寸调整 StemPro Accutase 溶液的用量（请参见表1）。

    表1试剂用量（mL/孔或 mL/培养皿）

    培养容器表面积DPBSStemPro Accutase 溶液mESC EB 培养基
    6孔板10 cm2/孔2 mL/孔1 mL/孔2 mL/孔
    12孔板4 cm2/孔1 mL/孔0.5 mL/孔1 mL/孔
    24孔板2 cm2/孔0.5 mL/孔0.3 mL/孔0.5 mL/孔
    35 mm 培养皿10 cm22 mL1 mL2 mL
    60 mm 培养皿20 cm24 mL2 mL4 mL
    100 mm 培养皿60 cm212 mL5 mL12 mL
  5. 将培养皿在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育 1–2 分钟，直至单个细胞开始变圆。
  6. 向每个培养皿中加入适量的 mESC EB 培养基（参见表1），以停止解离反应。用移液管轻轻地充分上下吹吸解离的细胞，使集落分散成单细胞悬液。确保轻轻吹吸，以尽量减少气泡的形成。
  7. 将每个孔中的 mESC 悬液转移至单独的 15 mL 锥形管中，然后以 250 × g 离心试管5分钟以使细胞沉淀。
  8. 从 mESC 沉淀上小心吸出上清液。
  9. 用适量（约 2 mL）的 mESC EB 培养基重悬沉淀。
  10. 将重悬的细胞添加到已准备好的每个含 10 mL mESC EB 培养基的 100 mm 贴壁培养皿中。
  11. 将贴壁培养皿在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育40分钟，使 mESC 与 MEF 饲养层分离。
  12. 小心收集从 MEF 饲养层解离的 mESC，并使用 mESC EB 培养基将细胞浓度调节至 5.5 × 105 个细胞/mL。
  13. 将 5 mL 细胞悬液（浓度 5.5 × 105 个细胞/mL）铺于一个 100 mm 非贴壁培养皿（即未经组织培养处理）中。
  14. 将细胞在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育3天，使其形成 EB。每天更换用过的培养基。

    图1 Gibco 小鼠 (C57BL/6) ESC 衍生的拟胚体的明场图像 (10X)。让解离的小鼠 ESC 在非贴壁培养皿上聚集3天。

    Gibco 小鼠 (C57BL/6) ESC 衍生的拟胚体放大图像
  15. 在 AF 包被培养皿中，将 EB 铺于添加 10% FBS 的 mESC EB 培养基中。
  16. 将 EB 在 37°C、5% CO2 培养箱中孵育过夜，使其贴壁于培养皿。
    注：当细胞贴壁培养时，打开和关闭培养箱门时应小心，避免影响细胞在孔表面的均匀分布。
  17. EB 贴壁于培养皿后，吸出培养基并向培养皿中加入 mESC EB 培养基（不含 FBS）。将培养皿放回培养箱，并每隔一天更换一次用过的培养基。
  18. 在 EB 分化后第14天，用抗内胚层、中胚层和外胚层标志物的抗体对分化细胞进行染色。

    图2将 Gibco 小鼠 (C57BL/6) ESC 衍生的拟胚体转移到明胶包被的培养皿后，贴壁一天，分化14天。

    将 Gibco 小鼠 (C57BL/6) ESC 衍生的拟胚体转移到明胶包被的培养皿后，贴壁一天，分化14天放大图像

     

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mESC 拟胚体的免疫细胞化学染色

使用免疫细胞化学染色评价 mESC 分化为三个初级胚层的能力。使用抗中胚层标志物平滑肌肌动蛋白、外胚层标志物 βIII-微管蛋白和内胚层标志物甲胎蛋白的抗体对分化细胞（第14天）进行染色（参见表2）。

表2表型标志物

胚层抗原来源稀释比例抗体类型
外胚层βIII-微管蛋白Sigma，货号 T86601:1000小鼠 IgG2b
内胚层甲胎蛋白 (AFP)R&D Systems，货号 AF53691:200山羊 IgG
中胚层平滑肌肌动蛋白货号 08-01061:1小鼠 IgG1-κ

需要的其他材料

  • 不含钙、镁离子的 Dulbecco’s PBS (DPBS)（货号 14190-250）
  • 4% 多聚甲醛 (PFA)（US Biologicals，货号 19943）
  • 山羊血清（货号 10000C）
  • 牛血清白蛋白 (BSA)（货号 15561-020）
  • 二甲基亚砜 (DMSO)（Sigma，货号 D2650）
  • 1% Triton X-100（货号 HFH-10）
  • Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG 抗体（货号 A11037）
  • DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐）（货号 D3571）
  • ProLong Gold 抗淬灭剂（货号 P36930）（可选）

制备封闭缓冲液 (10 mL)

  1. 要制备 10 mL 封闭缓冲液，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分用量
    不含钙、镁离子的 DPBS7.2 mL
    山羊血清0.5 mL
    1% Triton X-1000.3 mL
    50 mg/mL BSA2.0 mL
  2. 封闭缓冲液可在 2–8°C 条件下储存最长2周。

DAPI 储备液 (10 mL)

  1. 要制备 10 mL DAPI 溶液，请在无菌条件下混合下列组分：

    组分用量
    DAPI10 mg
    二甲基亚砜10 mL

    分装并在 –20°C 下储存。用不含钙、镁离子的 DPBS 稀释 (1:1000)，制备工作溶液。

染色程序

  1. 从培养容器中吸出培养基。
  2. 使用 DPBS（不含钙、镁离子）冲洗细胞一次。
  3. 在室温下使用 4% PFA 固定细胞 15–20 分钟。
  4. 在室温下使用 DPBS（不含钙、镁离子）冲洗细胞3次，每次5分钟。
  5. 在室温下将细胞在封闭缓冲液中封闭30分钟。
  6. 向细胞中分别加入每种一抗（以封闭缓冲液稀释的 βIII-微管蛋白、甲胎蛋白和平滑肌肌动蛋白，如上表2所示）。每 100 mm 培养皿使用 6 mL（总体积）。
  7. 将细胞与一抗在 4°C 条件下孵育过夜。
  8. 第二天，在室温下使用 DPBS（不含钙、镁离子）冲洗细胞3次，每次10分钟。
  9. 用在封闭缓冲液中稀释的二抗 Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG (1:1000) 处理细胞。每 100 mm 培养皿使用 6 mL。
  10. 将细胞与二抗在室温下孵育1小时。
  11. 在室温下使用 DPBS（不含钙、镁离子）冲洗细胞2次，每次10分钟。
  12. 使用 DAPI 工作溶液（按照上面的说明稀释）染色细胞5分钟。
  13. 使用 DPBS（不含钙、镁离子）冲洗细胞10分钟，再进行观察。
  14. 此时，可使用 ProLong Gold 抗淬灭试剂进行最终洗涤步骤。
图3分化第14天时用抗中胚层标志物平滑肌肌动蛋白、外胚层标志物 βIII-微管蛋白和内胚层标志物 AFP 的抗体染色的 Gibco 小鼠 (C57BL/6) ESC 拟胚体分化荧光图像 (20X)（红色，左图）。细胞核用 DAPI 复染（蓝色，右图）。

 

Gibco 小鼠 (C57BL/6) ESC 拟胚体分化荧光图像 (20X)

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附录

A. 在 mESC EB 培养基中，KnockOut™ DMEM（货号 10829-018）可替换为以下替代物：

KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）

如需使用 KnockOut™ DMEM/F-12 制备 100 mL mESC EB 完全培养基，请在无菌条件下混合下表中列出的组分。

组分储备液浓度最终浓度用量
KnockOut™ DMEM/F-12（货号 12660-012）—1X83 mL
KnockOut™ 血清替代物 (KSR)
（货号 10828-028）		—15%15 mL
GlutaMAX™-I（货号 35050-061）200 mM2 mM1 mL
MEM 非必需氨基酸溶液（货号 11140-050）10 mM0.1 mM1 mL

B. 用于收获 mESC 的解离酶/工具

解离酶/工具应用建议浓度
TrypLE™ Express（货号 12604-021）解离成单细胞1X 即用型

参考文献

  1. Evans, M., Kaufman, M. (1981) Establishment in culture of pluripotent cells from mouse embryos.Nature 292, 154–156.
  2. Martin, G. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells.Proc Natl Acad Sci USA 78, 7634–7638. 

MAN0007199         2012年8月22日

仅供研究使用。不得用于人或动物的任何治疗或诊断用途。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。