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蛋白质富集技术涵盖多种方法,可基于蛋白序列、抗体表位、翻译后修饰(PTM)或活性结合位点分离细胞蛋白。该技术对分离低丰度蛋白及降低蛋白质组分析样本复杂度至关重要。采用免疫亲和技术(如免疫沉淀)可高效富集特定蛋白或复合物, 或通过PTM特异性亲和结合(如磷酸化蛋白富集)针对翻译后修饰进行定向分离。新型的Thermo Scientific ActivX™ 探针与富集试剂盒能特异性靶向激酶、GTP酶、丝氨酸水解酶等酶类。
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|---|---|---|---|---|---|
| 磷酸化蛋白富集试剂盒 | 链霉亲和素IP-MS 试剂盒 | Protein A/G IP-MS 试剂盒 | 激酶富集试剂盒(含ATP探针) | ActivX TAMRA-FP 丝氨酸水解酶探针 | |
| 典型研究目标 | 发现蛋白质组学 | 靶向蛋白质学 | 靶向蛋白质学 | 发现蛋白质组学 | 发现蛋白质组学 |
| 靶标 | 磷酸化蛋白 | 单一/同源蛋白 | 单一/同源蛋白 | ATP 结合位点 | 活性丝氨酸水解酶 |
| 结合/标记机制 | 金属螯合亲和磷酸基团 | 生物素化抗体靶向结合 | 抗体靶向结合 | 生物素化 ATP 类似物结合活性位点赖氨酸 | TAMRA 标记氟磷酸酯结合活性位点丝氨酸 |
| 富集步骤 | 酶解前(蛋白) | 酶解前(蛋白) | 酶解前(蛋白) | 酶解后(肽段) | 酶解后(肽段) |
| 富集形式 | IMAC | 固定化链霉亲和素 | 固定化Protein A/G | 固定化链霉亲和素 | 固定化抗 TAMRA 单抗 |
| 基底珠类型 | 琼脂糖珠 | 磁珠 | 磁珠 | 琼脂糖珠 | 琼脂糖珠 |
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| 靶标 | A431 | HEK293 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 靶标抗体组 | 阴性对照组 | 靶标抗体组 | 阴性对照组 | ||
| 序列覆盖率(%) | EGFR | 65% | 0% | 16% | 0% |
| AKT1 | 36% | 2% | 68% | 6% | |
| AKT2 | 50% | 0% | 82% | 0% | |
| AKT3 | 8% | 0% | 62% | 0% | |
| PTEN | 16% | 0% | 36% | 0% | |
使用Thermo Scientific Pierce链霉亲和素磁珠对中低丰度EGFR-AKT通路靶标进行质谱富集分析。 从A431和HEK293细胞系中,使用生物素化抗体对EGFR-AKT通路靶标进行免疫沉淀,通过Pierce链霉亲和素磁珠捕获抗原-抗体复合物。IP洗脱液进行溶液内酶切消化,通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)评估序列覆盖率,并鉴定异构体特异性肽段。
Western blot与质谱联用技术可实现酶的靶向捕获与分析与。该示意图描述了使用 ActivX 探针对激酶、GTP 酶或丝氨酸水解酶进行剖析、捕获和检测的两个并行工作流程。用抑制剂对酶进行预孵育,可以通过探针标记蛋白质的 Western 印迹(或仅针对丝氨酸水解酶的荧光 SDS-PAGE)或探针标记肽的质谱分析来确定抑制剂的特异性、结合亲和力和效力。
| 靶标 | A431 | HEK293 | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 靶标抗体组 | 阴性对照组 | 靶标抗体组 | 阴性对照组 | ||
| 序列覆盖率(%) | EGFR | 65% | 0% | 16% | 0% |
| AKT1 | 36% | 2% | 68% | 6% | |
| AKT2 | 50% | 0% | 82% | 0% | |
| AKT3 | 8% | 0% | 62% | 0% | |
| PTEN | 16% | 0% | 36% | 0% | |
使用Thermo Scientific Pierce链霉亲和素磁珠对中低丰度EGFR-AKT通路靶标进行质谱富集分析。 从A431和HEK293细胞系中,使用生物素化抗体对EGFR-AKT通路靶标进行免疫沉淀,通过Pierce链霉亲和素磁珠捕获抗原-抗体复合物。IP洗脱液进行溶液内酶切消化,通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)评估序列覆盖率,并鉴定异构体特异性肽段。
Western blot与质谱联用技术可实现酶的靶向捕获与分析与。该示意图描述了使用 ActivX 探针对激酶、GTP 酶或丝氨酸水解酶进行剖析、捕获和检测的两个并行工作流程。用抑制剂对酶进行预孵育,可以通过探针标记蛋白质的 Western 印迹(或仅针对丝氨酸水解酶的荧光 SDS-PAGE)或探针标记肽的质谱分析来确定抑制剂的特异性、结合亲和力和效力。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。
