Click-iT® EdU 成像套件的图像

基于 DNA 合成的细胞增殖检测

在该检测中，将经修饰的胸苷类似物 EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，胸苷的核苷类似物）有效地掺入新合成的 DNA 中，并在快速、高度特异性的温和 click 反应中用明亮的、光稳定的 Alexa Fluor®染料进行荧光标记

订购Click-iT® EdU 成像试剂盒

此方案可以用于：

  • 使用荧光显微镜检测 DNA 合成

此方案不能用 于：

完成此方案需要以下材料：

  • Click-iT® EdU 成像试剂盒（货号： C10338， C10340， C10337， C10339）
  • PBS（货号：10010-023）
  • 固定剂（例如 PBS 中 3.7% 甲醛，货号：R37602）
  • 透化试剂（例如 PBS 中 0.5% Triton® X-100 ，货号：R37602）
  • 含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 溶液（含 3% BSA 的 PBS 溶液）， pH 7.4
  • 去离子水
  • 18 x 18 mm 盖玻片
  • 可选：6 孔微孔板

方案

制备储备溶液

  1. 让小瓶升至室温
  2. 向组分 A 中加入 2 mL DMSO（组分 C）或水溶液，制得 10 mM EdU 储备液。-20°C 储存
  3. 向组分 D 中加入 36 mL 去离子水，制备 1X Click-iT® EdU 反应缓冲液 。2 – 8° C 储存
  4. 向组分 B 中加入 70 μL DMSO（组分 C），制备 Alexa Fluor® 叠氮化物 ，然后充分混合。-20°C 储存 
  5. 向组分 F 中加入 2 mL 去离子水并混合，制备 10X Click-iT® EdU 缓冲液添加剂。 -20°C 储存 
  6. 用 PBS 按 1:2000 的比例稀释 Hoechst® 33342（组分 G）以获得 1X 溶液

使用 EdU 标记细胞

  1. 将细胞置于盖玻片上并孵育过夜
  2. 将 10 μL 的 10 mM EdU 储备液稀释至 5 mL 预热的组织培养基中，制备 20 μM EdU 标记溶液（足够用于 10 个盖玻片）
  3. 从细胞中去除一半培养基
  4. 替换为等体积的 EdU 标记溶液（最终浓度10 μM）
  5. 在适当的生长条件下孵育细胞，处理两小时。生长缓慢的细胞可能需要更长的孵育时间
  6. 立即进行固定和透化

固定并透化细胞

  1. 将每个盖玻片转移至 6 孔板的一个孔中
  2. 向每个孔中加入 1 mL 含 3.7% 甲醛的 PBS 溶液
  3. 在室温下孵育15分钟
  4. 去除甲醛，用 1 mL 含 3% BSA 的 PBS 溶液洗涤两次
  5. 去除洗涤液并在每个孔中加入 1 mL 含 0.5% Triton® X-100 的 PBS 溶液
  6. 在室温下孵育 20 分钟

 

方案提示

  • 针对 体内 实验，可单独购买额外的 EdU（货号： A10044， E10187）
  • 可使用甲醇和皂素等固定/透化试剂替换随附的 Triton® X-100

Click-iT® 标记技术的细胞图像
利用 Click-iT® EdU成像试剂盒进行多色成像。

检测 EdU

  1. 用去离子水按 1:10 的比例稀释上述制备的 10X 溶液，制备 1X Click-iT® EdU 缓冲添加剂 。请在 8 小时内使用此溶液
  2. 按照下表制备 Click-iT® 反应混合物按照表中列出的顺序添加成分

    反应组分*
    盖玻片数量
     1245102550
    1X Click-iT® EdU 反应缓冲液430 µL860 µL1.8 mL2.2 mL4.3 mL10.7 mL21.4 mL
    CuSO4 （组分E）20 µL40 µL80 µL100 µL200 µL500 µL1 mL
    Alexa Fluor® 叠氮化物1.2 µL2.5 µL5 µL6 µL12.5 µL31 µL62 µL
    1X Click-iT® EdU 缓冲添加剂50 µL100 µL200 µL250 µL500 µL1.25 mL2.5 mL
    总容量500 µL1 mL2 mL2.5 mL5 mL12.5 mL25 mL
    *注意：按照表中列出的顺序添加成分。
  3. 从细胞中去除透化缓冲液并用 1 mL 含 3% BSA 的 PBS 溶液洗涤两次
  4. 去除洗涤液
  5. 向每个孔中加入 0.5 mL Click-iT® 反应混合物。短暂摇动平板，确保反应混合物均匀分布
  6. 在室温下避光孵育平板 30 分钟
  7. 去除反应混合物并用 1 mL 含 3% BSA 的 PBS 溶液洗涤每个孔

其他标记

  1. 目前对样品进行抗体标记
  2. 用 1 mL PBS 溶液洗涤每个孔。去除洗涤液
  3. 每孔加入 1 mL 1X Hoechst® 33342 溶液
  4. 在室温下避光孵育 30 分钟
  5. 去除 Hoechst® 33342 溶液
  6. 用 1 mL PBS 溶液将每个孔洗涤两次
  7. 去除洗涤液

图像

  1. 采用 Click- iT® EdU 标记的细胞可与所有玻片制备方法兼容，包括水浸片或制备的封片剂
  2. 使用下列适当滤光片对细胞进行成像

     Hoechst® 33342Alexa Fluor® 488Alexa Fluor® 555Alexa Fluor® 594Alexa Fluor® 647
    激发/发射（单位： nm）350/461495/519555/565590/615650/670
    标准滤光片组DAPIFITCRFPTRITCCy®5