Note: This protocol is intended for use with the specific products mentioned within it. Substituting different products is not recommended.

简介

细胞表面标志物可根据谱系和发育阶段定义细胞亚群，还可根据用荧光抗体标记并通过流式细胞术分析时的功能进行定义。 这些表面标志物具有不同的形式和功能，包括可溶性配体和细胞结合配体的受体、离子通道、糖蛋白、磷脂等。 例如，CD4是辅助性T细胞的表面标志物，该细胞可基于其他趋化因子受体和分化簇（CD）标志物的表达而进一步分化。 可基于独特的染色分群对抗体染色的活细胞进行分选并用于其他实验。

细胞表面靶标染色操作步骤
一般注意事项
  • 为了获得荧光染料抗体的最佳性能，请将抗体2-8°C 避光保存。 切勿冷冻。
  • 使用前，快速离心抗体以恢复最大体积。 不建议涡旋抗体。
  • 除非操作步骤中注明，否则所有染色操作应在冰上或在2-8°C下进行并尽可能避光。
  • 如果用荧光染料抗体染色后需要保存样品，则将100 μL 样品与100 μL IC固定液（货号00-8222）混合，从而将样品保存在IC固定液中；或者加入2 mL 1步固定/裂解液（货号00-5333）。 在这些缓冲液中，样品可2–8°C避光保存3天。
    • 注： 在使用IC固定液（货号00-8222）或1步固定/裂解液（货号00-5333）保存样品时，对染色亮度或偶联染料（例如 Invitrogen™ APC-eFluor™ 780或PE-Cyanine 7）的FRET效率/补偿的影响似乎很小。 固定液质量的差异会影响荧光染料亮度或FRET效率。 可以对固定后的荧光染料性能进行一些归纳，但应根据经验确定克隆特异性能。
    • 注： 在固定样品之前，建议用可固定活力染料（FVD）进行染色，以便在流式细胞术分析过程中对活细胞进行选择。

操作步骤 A：细胞悬液

材料

  • 12 x 75 mm圆底试管或96孔U型或V型底微量滴定板
  • 一抗（荧光直标或纯化的）
  • 必要时可使用二级试剂（用于间接染色）
  • 纯化的抗小鼠Cd16/32（货号 14-0161）或纯化的人14-0161）或纯化的人FC受体结合抑制剂
  • 流式细胞分析染色液（货号00-4222）
  • [可选]细胞活性溶液：
    • 7-AAD细胞活性染色液（货号00-6993）
    • 碘化丙啶染色液（货号00-6990）
    •  Invitrogen™产品线，如可固定化活性染料 eFluor™ 455UV（货号65-0868）、eFluor™ 450（货号65-0863）、eFluor™ 506（货号65-0866）、eFluor™ 660（货号65-0864）和eFluor™ 780（货号65-0865）

实验步骤

注意： 抗体结合和温度有关。 在冰上染色可能需要更长的孵育时间。 另外，一些抗体可能需要非标准孵育条件，这些条件将在随抗体提供的技术说明书中注明。

  1. 按照我们的最佳操作步骤部分中“流式细胞术细胞制备操作步骤”所述制备细胞。
  2. [可选]阻断非特异性Fc介导的相互作用：
    • 小鼠细胞： 染色前，将细胞用0.5-1 μg纯化的抗小鼠 CD16/CD32/100 μL 2-25°C预孵育10-20分钟。
    • 人类细胞： 染色前，将细胞用20 μL纯化的人Fc受体结合抑制剂/100 μL 2-25°C预孵育10-20分钟。
  3. 每个管或孔加入等量的50 μL细胞悬液（105-108个细胞）
  4. 将推荐量的各种一抗在适当体积的流式细胞术染色液中进行混合并加入细胞中，使最终的染色体积为100 μL（即50 μL细胞样品 + 50 μL抗体混合物）。 轻轻地脉冲涡旋混合。
    • 注意： 对于纯化或生物素化的一抗，进行第8步
  5. 2-8°C或冰上孵育30分钟以上。 避光。
  6. 加入流式细胞术染色液洗涤细胞。 对于微量滴定板，使用2 mL/管或200 μL/孔。 在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。
  7. 重复第6步。
    • 注意： 如果所有一抗均直接与荧光染料结合，则进行第14步。
  8. 2-8°C或冰上孵育60分钟。
  9. 加入流式细胞术染色液洗涤细胞。 对于微量滴定板，使用2 mL/管或200 μL/孔。 在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。
  10. 重复第9步。
  11. 将适量荧光染料标记的二级试剂稀释于100 μL流式细胞术染色液中，加入细胞中。 2-8 °C或冰上孵育30分钟以上。 避光。
  12. 加入流式细胞术染色液洗涤细胞。 对于微量滴定板，使用2 mL/管或200 μL/孔。 在室温下400-600 x g离心5分钟。 弃上清。
  13. 重复第12步。
  14. [可选]根据我们的最佳操作步骤部分中恰当的“细胞活性染色方案”，用活性染料对样品进行染色。
  15. [可选]分析前需要保存样品时，可将细胞重悬于100 μL流式细胞术染色液中，加入 100 μL CIM固定液或2 mL 一步固定/裂解液。
  16. 将细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。
  17. 通过流式细胞术分析样品。

操作步骤B：人裂红全血

在用荧光染料抗体对全血进行染色后，可使用10X RBC裂解液（适用于多物种）或一步固定/裂解液 (10X) 裂解RBC。 另外，一步固定/裂解液 (10X) 可一步裂解RBC并固定白细胞。 如果在染色前使用一步固定/裂解液制备裂解全血细胞，请确定染色组中的抗体能识别目标抗原上的固定表位。 有关固定/透化后抗体克隆性能的信息，请参阅“固定后的抗体克隆性能”表（第 60 页）。

材料

  • 10X RBC裂解液（适用于多物种）（货号00-4300或一步固定/裂解液 (10X)（货号00-5333）
    • 注意： 使用前，10X RBC 裂解液（适用于多物种）和1步固定/裂解液(10X) 必须通过加入1份缓冲液和9份室温试剂级水稀释至1X。
  • 12 x 75 mm 圆底试管
  • 一抗（直接或纯化的）
  • 必要时可使用二级试剂（用于间接染色）
  • 纯化的人FC受体结合抑制剂
  • 流式细胞分析染色液（货号00-4222）
  • [可选]活力溶液：
    • 7-AAD 细胞活性染色液（货号00-6993）
    • 碘化丙啶染色液（货号00-6990）
    • Invitrogen™ 产品线，如可固定化活性染料 eFluor™ 455UV（货号65-0868）、eFluor™ 450（货号65-0863）、eFluor™ 506（货号65-0866）、eFluor™ 660（货号65-0864）和eFluor™ 780（货号65-0865）

实验步骤

注意： 抗体结合和温度有关。 在冰上染色可能需要更长的孵育时间。 另外，一些抗体可能需要非标准孵育条件，这些条件将在随抗体提供的技术数据表中注明。

  1. 每个管中加入等量的100 μL全血
  2. [可选]每100 μL血液用20 μL纯化的人Fc受体结合抑制剂阻断非特异性Fc受体介导的相互作用。 2-8 °C或室温孵育10-20分钟。
  3. 将推荐量的各种一抗在适当体积的流式细胞术染色液中进行混合，使抗体混合物的最终体积为50 μL。 加入细胞中。 轻轻地脉冲涡旋混合。
  4. 在室温下孵育20-30分钟。 避光。
    • 注意： 如果所有一抗均直接与荧光染料结合，则进行第7步。

    5. 对于纯化抗体或生物素结合抗体：

  5. 加入2 mL流式细胞术染色液洗涤细胞。 在室温下400-600 x g离心5分钟。 小心弃上清
  6. 将适量荧光染料标记的二级试剂稀释于100 μL流式细胞术染色液中，加入细胞中。 2-8°C或冰上孵育15–30分钟。 避光。
  7. 在不洗涤细胞的情况下，加入2 mL新鲜制备的1X RBC裂解溶液并短暂脉冲涡旋。 在室温下孵育10-20分钟。 避光。
    • 注意： 如果使用10X RBC裂解液（适用于多物种）（货号00-4300），请勿孵育超过20分钟。
  8. 在室温下400-600 x g离心样品5分钟。 弃上清。
  9. 加入2 mL流式细胞术染色液，在室温下400-660 x g离心5分钟。弃上清。 弃上清。
  10. 重复第9步。
  11. [可选]对于使用10X RBC裂解液裂解的细胞，根据最佳操作步骤部分中恰当的
    “活力染料染色操作步骤”，用活力染料对样品进行染色。
    • 注意： 碘化丙啶或7-AAD等活力染料不兼容于使用一步固定/裂解液裂解的细胞，因为固定可导致细胞透化。 在使用1步固定/裂解液之前，可固定化活性染料（FVD）对全血进行染色；有关详细信息，请参阅最佳操作步骤部分中的“活力染料染色操作步骤”。
  12. 将细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中。
  13. 通过流式细胞术分析样品。