CellTrace Violet 细胞增殖试验方案

CellTrace Violet 试剂盒通过染料荧光的稀释来监测增殖细胞的不同世代。活细胞被非常明亮，稳定的染料共价标记。流式细胞术直方图中各代细胞表现出不同的峰高。

配制培养基

1. 向 1 L 的 OpTmizer  T 细胞扩增SFM培养基中加入以下试剂：
   • 26 mL 的 T 细胞扩增添加剂（货号：A10485-01）
   • 10 mL 的青霉素-链霉素-谷氨酰胺
2. 在 2–8°C 下避光储存可稳定4周

从全血中分离单核细胞

1. 用 10 mL PBS稀释10 mL 全血，混匀
2. 往50 mL 离心管加入 15 mL Ficoll-Paque™ Plus，然后轻轻沿壁往溶液上面加入 20 mL 稀释后的全血
3. 400 x g 离心 30 分钟
4. 小心吸取淋巴细胞层并将其转移到新试管中
5. 在 50 mL 锥形管中，用 25 mL DPBS 缓冲液重悬细胞
6. 300 x g 离心 5 分钟，倒出上清液，用 25 mL DPBS 重悬
7. 重复洗涤步骤，细胞重悬于 10 mL DPBS 中
8. 使用 Countess 自动细胞计数仪或通过其他方法计算细胞数量；将浓度调整到 10⁶ 个细胞/mL

细胞染色

1. 向一瓶CellTrace Violet 染色液加入 20 µL DMSO
2. 将该储备液稀释到 20 mL 的 PBS（预热到 37°C）中，则染色液浓度为5 µM
3. 向 50 mL 离心管中加入 10 mL 的细胞
4. 300 x g 离心细胞 5 分钟，小心地倒出上清液
5. 用 10 mL 的 CellTrace Violet 染色液将细胞重悬
6. 将细胞置于在37°C 水浴槽中孵育 20 分钟
7. 向细胞加入 40 mL OpTmizer T 细胞扩增 SFM 培养基，以除掉未结合的染料
8. 孵育细胞 5 分钟
9. 300 x g 离心细胞 5 分钟，用预热的OpTmizer T 细胞扩增 SFM 培养基重悬细胞

刺激和分析

1. 将已染色的细胞平均分到培养板或烧瓶中
2. 使用 50 µL Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 或其他刺激物进行刺激 1 mL 的细胞
3. 培养适当的时间
4. 收集细胞，适当时对其他标志物进行染色
5. 使用具有 405 nm 激发光和 450/40 带通的流式细胞仪进行分析

使用 CellTrace Violet 试剂对人 PBMC 染色，然后培养 7 天。该直方图中的离散峰代表活细胞的连续分裂。 使用具有 405 nm 激发光和 450/40 nm 带通的 Attune 声波聚焦流式细胞仪完成分析。未刺激的第一代用红色表示。