ViewRNA 组织荧光检测实验方案

• 应严格遵守孵育时间和温度，以确保成功杂交。
• 所有涉及使用无 RNase 水的步骤都应使用无核酸酶的实验室器具和一次性移液器吸头进行，以避免 RNase 污染。
• 本方案不建议使用加湿组织培养箱作为杂交系统。
• 对于所有洗涤步骤，使用 200 mL 的指定洗涤液，以正确的洗涤技术进行。洗涤时，轻轻甩动玻片以小心去除多余的液体，请勿完全晾干样品。
• 在开始实验之前，预热稀释试剂到 40°C。由于稀释试剂的粘性，不建议进行分装，建议将整个试剂瓶加热至 40°C 并根据需要吸取。
• 方案中有一个可选的过夜存储步骤。

我们建议在每次实验设置阳性和阴性对照，以验证和解读您的结果。

阴性对照示例

• 不使用靶标探针对
• 使用靶标对应的编码链的探针对
• 使用组织样品中不存在的基因的探针对

阳性对照示例

• 管家基因：ACTB、GAPDH 或 UBC （有关对照探针选择的更多信息，请参阅用户指南，第13页）

使用 ViewRNA 温度校验套件将干烘箱温度校准至 40°C。使用干烘箱和加湿室（如 StainTray 玻片架）时，请确保达到适当的水位。StainTray 玻片架可由随附的湿纸巾和升高平台一起使用的封闭塑料腔室进行替换，以形成杂交室。

备注：FFPE 和冻存组织可用于本方案。组织制备步骤因样品而异。参考样品类型对应的制备方法。

FFPE 组织制备

烘干玻片 (可选)

在 60°C 下烘烤组织样品 1 小时，可促进组织粘附到样品载玻片上。如果您要制备自己的 FFPE 样品，可能需要执行此步骤。如果购买 FFPE 样品，请咨询供应商以了解烘焙是否已进行。

玻片上的脱蜡

1. 根据标准方案使用二甲苯脱蜡并再水化乙醇

进行热预处理

1. 用铝箔将 1X 的预处理溶液烧杯密封，置于加热板上。加热至 90-95°C
2. 将玻片放置在垂直玻片架中，并用镊子浸入加热的 1X 预处理溶液中。使用铝箔盖玻烧杯，在 90-95°C 下孵育以获得良好孵育时间。
   （备注：有关指导原则，请参阅用户指南第 29 页“预处理优化程序”）。
3. 使用镊子取出玻片架，并使用含有 200 mL 的 dd H₂O 的染色皿将玻片浸入 dd H₂O。频繁搅拌，清洗 1 分钟。
4. 轻轻倒出，重复洗涤，加入 200 mL 的新鲜 dd H₂O。
5. 将玻片架转移至含 1X PBS 的染色皿上。进行“画疏水屏障”部分。
   备注：从此刻开始，不要让组织切片干燥。热预处理后，切片可以在室温下用 1X PBS 覆盖并存放过夜。

储存玻片 (可选)

1. 热预处理后，可将玻片存放过夜。将玻片存放在含 200 mL 的储存缓冲液的透明染色皿中，可室温保存长达 24 小时。用盖子或密封膜盖上培养皿，以防止蒸发。

制备冷冻保存的组织

制备化合物包埋组织

1. 将组织切片添加到预冷却 4% 甲醛（Image-iT 固定液）中，并在 4°C 下固定过夜 (16-19小时)。
2. 用 200 mL 的 1X PBS 洗涤玻片1分钟。进行“画疏水屏障”部分。

储存玻片 (可选)

1. 固定后，可将玻片存放过夜。将玻片存放在含 200 mL 的储存缓冲液的透明染色皿中，可室温保存长达 24 小时。用盖子或密封膜盖上培养皿，以防止蒸发。

画疏水屏障

1. 使用 Pap Pen 在组织切片周围画一个疏水屏障。轻轻地描绘屏障2至4次。用 100 – 200 µL 的 1X PBS 覆盖组织，需足以完全覆盖样品而不接触疏水屏障以确保组织不会干透。
2. 使屏障在室温下干燥15-20分钟。
3. 进行“蛋白酶消化和固定”部分。

蛋白酶消化和固定

备注：开始此程序之前，确保将 1X PBS 预热到 40°C

1. 通过在预热的 1X PBS 中按 1:100 的比例稀释蛋白酶溶液来制备工作蛋白酶溶液，并短暂涡旋。
2. 从支架上取下各玻片，并轻扫以去除过量的 1X PBS。
3. 将玻片面朝上放入载玻片染色腔室中，立即在组织切片上加入 400 μL 的工作蛋白酶溶液，以确保覆盖组织切片。
4. 将玻片转移到干烘箱中，并在 40°C 下孵育适当时间。
   有关组织类型和建议孵育时间，请参见用户指南。
5. 从玻片中倒出工作蛋白酶溶液，洗涤玻片 200 mL 1X PBS 染色皿，轻轻摇动1分钟，使用新鲜的 1X PBS 再重复洗涤 1次。
6. 将载玻片架转移到含有 200 mL 固定液的染色皿上，并在通风橱下于室温下固定 5 分钟。
7. 用 200 mL 新鲜的 1X PBS 洗涤玻片1分钟，频繁搅拌。

备注：在开始此程序之前，确保探针对稀释液预热到 40°C。准备足够的体积，以便向每个样品添加 400 μL。

1. 通过将 ViewRNA探针对以 1:40 的比例在预热的探针对稀释液中稀释，来制备工作探针对溶液。将每个靶标探针对的 10 µL 稀释在预热的探针对稀释液中，以达到每张玻片 400 µL 的总体积。涡旋混匀，每载玻片加入 400 μL。 有关 1-4 plex 检测的建议稀释液，请参阅附录中表3。
   备注：对于低丰度靶标，请按 1:20 或 1:30 的比例稀释靶标探针。从支架上取下各玻片，并轻扫以去除过量的 1X PBS。
2. 将不超过 400 μL 的预热探针对稀释液加入阴性对照，并将不超过 400 400 μL 的工作探针对溶液加入每个测试样本。
3. 将玻片转移到干烘箱中，并在 40°C 下孵育 2 小时。
4. 从玻片中倒出工作探针对溶液，将玻片浸入包含洗涤缓冲液的玻片架中。
5. 在室温下使用新鲜 200 mL 洗涤缓冲液洗涤玻片3次（持续 2 分钟），保持持续搅拌。
6. 如果您计划在两天内执行检测，请进行“存放玻片”步骤，否则请进行“放大和检测信号”步骤。

存放玻片 (可选)

1. 将玻片存放在含 200 mL 的储存缓冲液的透明染色皿中，可室温保存长达 24 小时。用盖子或密封膜盖上培养皿，以防止蒸发。

清洗存放的玻片 (如为当天方案，请跳过此步骤)

备注：开始此步骤之前，确保扩增和检测试剂已预热到 40°C。

1. 从保存缓冲液中取出。将玻片架转移到含洗涤缓冲液的透明染色盘中，并频繁搅拌洗涤2分钟。
2. 倒出洗涤缓冲液，用 200 mL 的新鲜洗涤缓冲液再次洗涤2分钟，频繁搅拌。使用新鲜的洗涤缓冲液再重复洗涤1次。

开始信号放大

备注：在开始此程序之前，确保扩增剂稀释液 QF 已预热到 40°C。

1. 通过混合的方式，在预热的扩增剂稀释液 QF 中以 1:25 稀释来制备预扩增剂工作液。
2. 取出每个玻片，然后轻弹以取出洗涤缓冲液。将玻片面朝上放入载玻片染色腔室位于立即在组织切片上加入 400 μL 的预扩增剂工作液，以确保覆盖组织切片。
3. 将玻片转移到杂交系统，并在 40°C 下孵育30分钟。
4. 将一个空玻片架插入含有 200 mL 洗涤缓冲液的透明染色皿中。
5. 从玻片上倒出预扩增剂工作液，然后将其插入到洗涤缓冲液中的玻片架中。
6. 在室温下清洗玻片2分钟，并持续搅拌。使用新鲜洗涤缓冲液重复此步骤，总共洗涤3次。
7. 通过短暂的旋转并将其在预热的扩增剂稀释液 QF 中以 1:25 稀释来制备工作扩增剂混合液。
8. 取出每个玻片，然后轻弹以取出洗涤缓冲液。将玻片面朝上放入载玻片染色腔室位于立即在组织切片上加入 400 μL 的扩增剂混合物，以确保覆盖组织切片。
9. 将玻片转移到杂交系统，并在 40°C 下孵育30分钟。
10. 将一个空玻片架插入含有 200 mL 洗涤缓冲液的透明染色皿中。
11. 从玻片上倒出扩增剂混合物，然后将其插入到洗涤缓冲液中的玻片架中。
12. 在室温下清洗玻片2分钟，并持续搅拌。使用新鲜洗涤缓冲液重复此步骤，总共洗涤3次。

进行标记探针杂交

备注：在开始此程序之前，确保标记探针稀释液 QF 已预热到 40°C。

1. 通过短暂的旋转并将标记探针以 1:25 的比例稀释在预热标记探针稀释液 QF 中，以制备工作标记探针混合物溶液。将每个标记探针的 16 µL 稀释在预热的标记探针稀释液中，以达到每张玻片有 400 µL 的总体积。短暂涡旋混匀。有关 1-4 plex 检测的建议稀释液，请参阅附录中表4。
2. 短暂涡旋混匀，并避光保护。
3. 取出每个玻片，然后轻弹以取出洗涤缓冲液。将玻片面朝上放入载玻片染色腔室位于立即在组织切片上加入 400 μL 的预热工作标记探针混合物，以确保覆盖组织切片。
4. 将玻片转移到杂交系统中，在 40°C 下孵育30分钟。
5. 将一个空玻片架插入含有 200 mL 洗涤缓冲液的透明染色皿中。
6. 从玻片上倒出标记探针混合物，然后将其插入到洗涤缓冲液中的玻片架中。
7. 在室温下清洗玻片2分钟，并持续搅拌。使用新鲜的洗涤缓冲液重复此步骤。
8. 使用洗涤缓冲液进行10分钟的最终洗涤，频繁搅拌。冲洗不要超过30分钟。
9. 进行“复染和封片以进行检测”。

（可选）：减少组织自发荧光

1. 从洗涤缓冲液中取出每个玻片，然后轻弹以去除多余的洗涤缓冲液。
2. 在室温下，使用新鲜的 1X PBS 洗涤载玻片三次，并频繁搅拌。
3. 通过组合等体积的 A、B 和 C 组分，制备 ReadyProbes 组织自发荧光淬灭试剂盒。
4. 向每份样本加入 400 μL 的已制备 ReadyProbes 溶液，然后在室温下孵育 5 分钟。
5. 在室温下，使用新鲜的 1X PBS 洗涤载玻片三次，并频繁搅拌。
6. 进行“复染和封片以进行检测”

复染和封片以进行检测

备注：对于 ViewRNA 组织荧光测定，强烈建议使用含抗淬灭剂的封片剂。

1. 使用标准方案用 DAPI 对组织进行复染。
2. 使用具有抗淬灭特性的封片剂封片盖玻片。建议将 ProLong Glass 试剂用于硬质封片和对组织样品的长期储存。如果需要移除盖玻片，建议使用 SlowFade Glass 试剂进行软质封片。
   备注：为获得良好结果，请遵循封片剂提供的说明。
3. 使用兼容的成像系统（如倒置荧光显微镜或 HCS 平台）分析组织。

表 1.荧光探针对类型的定义。
这些荧光基团的光谱特性可在我们的在线荧光基团选择指南中找到。

表2.ViewRNA 组织荧光试剂盒与模块选项。

表3.靶标探针对稀释示例。

表4.建议的标记探针稀释液。