Note: This protocol is intended for use with the specific products mentioned within it. Substituting different products is not recommended.

介绍

在使用外周血或某些淋巴组织悬液进行流式细胞术分析或体外测定之前，应去除红细胞（RBC）。1X RBC 裂解缓冲液（货号：00-4333）和 10X RBC 裂解缓冲液（多物种）（货号：00-4300）可用于优化人外周血和小鼠组织（例如脾脏）单细胞悬液中的红细胞裂解。这两种缓冲液中含有氯化铵。氯化铵可裂解 RBC，且对白细胞的影响极小。当使用人外周血进行流式细胞术分析时，可以将 RBC 裂解步骤纳入染色方案中。一步法固定/裂解溶液（10X）（货号：00-5333）可用于在使用荧光染料偶联抗体染色后，裂解 RBC，同时固定外周血白细胞。所有 RBC 裂解试剂均与荧光染料偶联抗体相容。

红细胞（RBC）裂解方案

方案 A：使用 1X 或 10X RBC 裂解缓冲液

1X 和 10X RBC 缓冲液均采用基于氯化铵的渗透压冲击破碎法来裂解全血（使用肝素或 EDTA 作为抗凝血剂）或组织制剂中的红细胞。10X RBC 裂解缓冲液（多物种）专门用于优化外周血中 RBC 的裂解。经验证可用于人、小鼠、大鼠、犬和非人灵长类动物来源全血。1X RBC 裂解缓冲液经过优化，可裂解人外周血或小鼠造血组织（如脾脏或骨髓）单细胞悬液中的 RBC。

一般注意事项

  • 使用 10X RBC 裂解缓冲液（多物种）前，必须用室温试剂级水以 1:10 的比例稀释。
  • 实验表明，10X RBC 裂解缓冲液（多物种）在使用肝素或 EDTA 作为抗凝血剂采集的血液中具有同等作用。
  • 通常，少量残留的 RBC 不会干扰细胞的后续使用，并且可以在流式细胞术分析过程中通过门控排除；但是如有需要，可以进行第二轮裂解。

材料

  • 1X PBS
  • 10X RBC 裂解缓冲液（多物种）（货号：00-4300）或 1X RBC 裂解缓冲液（货号：00-4333）
  • 50 mL 锥形管
  • 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）或其他专用缓冲液
  • 12 x 75 mm 圆底试管
  • 一级抗体（直接偶联）

实验步骤

A1.在抗体染色后进行外周全血裂解

备注：有关抗体染色前的 RBC 裂解，请参阅大体积裂解方案（方案 A2）。

  1. 将全血样本等分到试管中。
    • 对于人，使用 100 µl 的血液。
    • 对于小鼠，使用 50-100 µl 的血液。
    • 对于大鼠，使用 50-100 µl 的血液。
    • 对于犬，使用 100 µl 的血液。
    • 对于非人灵长类动物，使用 100 µl 的血液。
  2. 加入染色所需的抗体（体积不超过 50 µL），充分混合。请参阅我们最佳方案中的“流式细胞术细胞表面靶标染色方案”。
  3. 在室温下避光培养 30 分钟。
  4. 加入 2 mL 的室温 1X RBC 裂解缓冲液，然后通过脉冲涡旋或颠倒混匀。
  5. 在室温下避光培养。
    • 对于人，培养 10–15 分钟。
    • 对于小鼠，培养 4-10 分钟。
    • 对于大鼠，培养 4-10 分钟。
    • 对于犬，培养 10–15 分钟。
    • 对于非人灵长类动物，培养 10–15 分钟。
    • 备注：观察浊度，以此评价红细胞裂解情况。当样本变得澄清时，裂解完成。
  6. 裂解后，立即在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。倒出上清液。
  7. [可选]重复步骤 4-6。
    • 备注：通常不需要执行步骤 7，因为少量残留的红细胞不会干扰后续的测定，并且可以在流式细胞术分析过程中通过门控排除。
  8. 将细胞重悬于 2 mL 的流式细胞术染色缓冲液中，按照步骤 6 离心。
  9. 倒出上清液，将细胞沉淀物重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液中。
  10. 通过流式细胞术分析样本。
A2.人全血大体积裂解

备注：如需将细胞放入培养物中，采用无菌技术执行所有步骤。

  1. 向每 1 mL 的人血中加入 10 mL 的 1X RBC 裂解缓冲液。
  2. 在室温下培养 10-15 分钟（不超过 15 分钟）。
    • 备注：观察浊度，以此评价红细胞裂解情况。当样本变得澄清时，裂解完成。
  3. 在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。倒出上清液。
  4. 将沉淀物重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液或专用缓冲液中。
  5. 统计细胞数量，进行活性分析。
  6. 根据需要，继续进行细胞染色或培养。
A3.小鼠/大鼠脾脏或骨髓细胞裂解

备注：建议对小鼠和大鼠组织使用 1X RBC 裂解缓冲液（货号：00-4333）。

备注：如需将细胞放入培养物中，采用无菌技术执行所有步骤。

  1. 收集组织，制备单细胞悬液。请参阅我们最佳方案中的“流式细胞术细胞制备方案”。
  2. 在室温下以 500 x g 离心 5 分钟，沉淀细胞，倒出上清液。
  3. 将沉淀物重悬于 3-10 mL 的 1X RBC 裂解缓冲液中。
  4. 在室温下培养 4-5 分钟。
  5. 通过加入 20–30 mL 的 1X PBS，停止裂解反应。
  6. 立即在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。倒出上清液。
  7. 将细胞重悬于 2 mL 的流式细胞术染色缓冲液或专用缓冲液中，按照步骤 6 离心。倒出上清液。
  8. 将细胞重悬于适量的流式细胞术染色缓冲液或专用缓冲液中。
  9. 统计细胞数量，进行活性分析。
  10. 根据需要，继续进行细胞染色或细胞培养。
方案 B：使用一步法固定/裂解溶液

一步法固定/裂解溶液可裂解 RBC，同时固定其余的白细胞。该溶液适用于在分析前裂解并固定经抗体染色的血样。也可以用于在使用抗体染色前裂解 RBC 并固定细胞；但是，需确认待使用的抗体能够识别感兴趣抗原上的固定表位。一般来说，机械性破坏淋巴组织足以将细胞释放为单细胞悬液。

一般注意事项

  • 使用一步法固定/裂解溶液前，必须用室温试剂级水以 1:10 的比例稀释。
  • 实验表明，一步法固定/裂解溶液在使用肝素或 EDTA 作为抗凝血剂采集的血液中具有同等作用。

材料

  • 1X PBS
  • 一步法固定/裂解溶液（10X）（货号：00-5333）
  • 50 mL 锥形管
  • 流式细胞术染色缓冲液（货号：00-4222）
  • 12 x 75 mm 圆底试管
  • 一级抗体（直接偶联）

实验步骤

  1. 向 100 μL 的全血中加入表面染色所需的合适抗体，充分混合。
    请参阅我们最佳方案中的“ 流式细胞术细胞表面靶标染色方案”。
  2. 在室温下避光培养 30 分钟。
  3. 加入 2 mL 的室温 1X 一步法固定/裂解溶液，然后轻轻颠倒。
  4. 在室温下避光培养 15-60 分钟。
  5. [可选]在 2–8ºC 避光条件下，样本最多可在 1X 一步法固定/裂解溶液中储存 3 天，对亮度的影响很小。