Note: This protocol is intended for use with the specific products mentioned within it. Substituting different products is not recommended.

Annexin V细胞凋亡测定方案是一种常用的细胞凋亡检测方法。建议配合以下方案使用特定试剂盒。请参阅Annexin V 染色页面上实验条件和避免假阳性的讨论，或查看我们所有Annexin V V 产品的选择指南。
 

检测Annexin V 的流式细胞术方案

一般注意事项
  • 建议不要将 Invitrogen 可固定活性染料(FVD) eFluor 450 与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒一起使用。
  • 由于Annexin V 与 PS 的相互作用具有钙依赖性，在Annexin V 实验过程中，要避免使用含有 EDTA 或其他钙螯合剂的缓冲液。 
  • Annexin V只有在细胞膜完整的情况下才能当作细胞凋亡标志物。当细胞膜的完整性受到破坏时，Annexin V 会与细胞内的 PS 结合。
     

Annexin V 染色方案

材料

  • 12 x 75 mm 圆底试管 
  • 1X PBS 
  • Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒（下列任何一种试剂盒）。每种试剂盒包含单色Annexin V 试剂。
        ° eFluor 450 （货号：88-8006-72、88-8006-74）
        ° FITC（货号：88-8005-72、88-8005-74）
        ° PerCP-eFluor 710（货号：88-8008-72、88-8008-74）
        ° PE（货号：88-8102-72、88-8102-74）
        ° PE-Cyanine7（货号：88-8103-72、88-8103-74）
        ° APC（货号：88-8007-72、88-8007-74）
  • 10X 结合缓冲液

注意：PerCP-eFluor 710（货号：88-8008-72、88-8008-74）不含活性染料。我们建议它和 Invitrogen 可固定活性染料（FVD）配合使用，例如 FVD eFluor 660（货号：65-0864-14、65-0864-18）、FVD eFluor 506（货号：65-0866-14、65-0866-18）或 FVD eFluor 780（货号：65-0865-14、65-8065-18）。
 

实验步骤

  1. 将 1 份 10X 结合缓冲液与 9 份蒸馏水混合，制备 1X 结合缓冲液。 
  2. 收集细胞。 
  3. 将细胞用 1X PBS 洗涤一次，然后用 1X 结合缓冲液洗涤一次。 
  4. 1X 结合缓冲液将细胞重悬，使细胞浓度达到 1-5 x 106 个细胞/mL。 
  5. 往 100 μL 的细胞悬液中加入 5 μL 的荧光染料偶联的Annexin V 。 
  6.  在室温下孵育 10-15 分钟。避光。 
  7. 加入 2 mL 1X 结合缓冲液，在室温下 400-600 x g 离心 5 分钟。丢弃上清液。 
  8. 用200 µL 的 1X 结合缓冲液将细胞重悬。 
  9. 加入 5 μL 的碘化丙啶染色液（PI)或 7-AAD 活性染色液，在冰上或室温下孵育 5-15 分钟。
    • 注意：配制的时候，PI和 7-AAD要注意避免洒出。在加入PI或 7-AAD 后，请勿清洗细胞。
  10. 使用流式细胞仪读取数据。
    • 注意：建议孵育后 4 小时内分析细胞，因为PI或 7-AAD 会对细胞活性不利。在准备开始分析之前，应 2–8°C 下避光储存。 

采用可固定活性染料的Annexin V染色方案

材料

  • 12 x 75 mm 圆底试管 
  • 1X PBS 
  • Annexin V 细胞凋亡检测试剂盒 （下列任何一种试剂盒）。每种试剂盒包含单色Annexin V试剂。
        ° eFluor 450 （货号：88-8006-72、88-8006-74）
        ° FITC（货号：88-8005-72、88-8005-74）
        ° PerCP-eFluor 710（货号：88-8008-72、88-8008-74）
        ° PE（货号：88-8102-72、88-8102-74）
        ° PE-Cyanine7（货号：88-8103-72、88-8103-74）
        ° APC（货号：88-8007-72、88-8007-74）
  • 10X 结合缓冲液 
  • 流式染色缓冲液（货号：00-4222） 
  • PBS（不含叠氮化物和血清/蛋白的 PBS） 
  • FVD eFluor 660（货号：65-0864-14、65-0864-18）、FVD eFluor 506（货号：65-0866-14、65-0866-18）或 FVD eFluor 780（货号：65-0865-14、65-8065-18）

注意：不要将 FVD eFluor 450 与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒一起使用。
 

实验步骤

  1. 将 1 份 10X 结合缓冲液与 9 份蒸馏水混合，制备 1X 结合缓冲液。 
  2. 用不含叠氮化物和血清/蛋白的 PBS 洗涤细胞两次。 
  3. 用不含叠氮化物和血清/蛋白的 PBS 重悬细胞，使浓度达到 1-10 x 106 个细胞/mL。 
  4. 往 1 mL 的细胞悬液中加入 1 µL 的 FVD，然后马上涡旋。 
  5. 在 2-8°C 下孵育 30 分钟。避光。 
  6. 用流式染色缓冲液或类似的缓冲液洗涤细胞两次。 
  7. 用 1X 结合缓冲液洗涤细胞一次。 
  8. 用1X 结合缓冲液重悬细胞，使细胞浓度达到 1-5 x 106 个细胞/mL。 
  9. 往100 μL 的细胞悬液加入 5 μL 的荧光染料偶联Annexin V。 
  10. 在室温下孵育10-15 分钟。避光。 
  11. 加入 2 mL 的 1X 结合缓冲液，在室温下 400-600 x g 离心 5 分钟。丢弃上清液。 
  12. 200 μL 的 1X 结合缓冲液重悬细胞。 
  13. 使用流式细胞术进行分析。

表面和细胞内染色的Annexin V染色方案

材料

注意： 建议不要将 FVD eFluor 450 与Annexin V细胞凋亡检测试剂盒一起使用。
 

实验步骤

  1. 将 1 份 10X 结合缓冲液与 9 份蒸馏水混合，制备 1X 结合缓冲液。 
  2. 对细胞表面抗原进行染色。请参阅“细胞表面靶标染色，方案 A”。 
  3. 用不含叠氮化物和血清/蛋白的 PBS 清洗细胞两次。 
  4. 用不含叠氮化物和血清/蛋白的 PBS 重悬细胞，使浓度达到 1-10 x 106 个细胞/mL。 
  5. 往 1 mL 的细胞加入 1 µL 的可固定活性染料，然后马上涡旋。 
  6. 在 2-8°C 下孵育 30 分钟。避光。  
  7. 用流式染色缓冲液或类似的缓冲液清洗细胞两次。 
  8. 用 1X 结合缓冲液清洗细胞一次。 
  9. 用 1X 结合缓冲液重悬细胞，使细胞浓度达到 1-5 x 106 个细胞/mL。 
  10. 往100 μL 的细胞悬液中加入 5 μL 的荧光染料偶联Annexin V。 
  11. 在室温孵育 10-15 分钟。避光。 
  12. 用 1X 结合缓冲液洗涤细胞一次。 
  13. 对细胞内抗原进行染色。请参阅“细胞内抗原染色，方案 A 或 B”。 
  14. 使用流式细胞仪读取数据。
     

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