引言

多重检测对空间生物学研究至关重要，因为它可以同时检测单个组织样品中的多个靶点分子。酶介导的信号扩增技术中荧光基团是共价结合的，特别适用于组织的多重检测。这样可以通过多轮添加和去除一抗和二抗来检测多种目标蛋白，而不会显著降低信号的荧光强度。

请务必注意，Invitrogen SuperBoost 试剂盒专门设计用于细胞和组织中的 低参数成像应用。这些试剂盒提供增强的信号扩增，可提高灵敏度并改善样品中靶标分子的检测。 Invitrogen Aluora 空间扩增试剂盒 也可增强信号扩增，专为 FFPE 组织样品中的高重成像（多达8重）而开发。Aluora 试剂有助于在单个样品中同时检测和可视化多个靶分子，有助于更深入地了解生物系统中的空间关系和细胞相互作用。

如何进行：Invitrogen SuperBoost 酪胺信号放大

无论使用 Invitrogen SuperBoost 还是 Aluora 空间扩增试剂盒检测组织样本中的靶标分子，都可以遵循此方法。该方法从玻片上的未标记 FFPE 组织样品开始，得到荧光染料标记的多色组织样品。然后，已标记的组织可随时用于各种荧光显微镜的空间成像，包括 Invitrogen EVOS M7000 成像系统和 CellInsight CX7 仪器，或者，如Akoya PhenoImager 和 EVOS S1000 系统的空间成像系统。为了在多通路检测过程中增加便利性和效率，可使用诸如徕卡 Bond RX 系统等自动玻片染色器执行这些步骤。


材料

所需材料

可选材料


程序准则和建议
  • 不要让组织样本干燥。干燥的组织会导致假信号或无信号。确保在孵育和洗涤步骤中有足够的溶液完全覆盖组织。我们建议使用加湿室 (例如带有湿纸巾的覆盖盒)。
  • 清晰的染色结果需要优化一抗稀释。
  • 采用 Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 试剂优化标记步骤对于获得增强信背比的高分辨率图像至关重要。
  • 如果是多通路荧光基团，请针对您的样品优化热诱导抗原决定簇 (抗原) 修复 (HIER) 程序。
  • 在使用当天制备试剂。

流程

准备试剂

Tyramide SuperBoost 试剂盒中包含的试剂Aluora 空间放大试剂盒中包含的试剂
封闭缓冲液 (10% 山羊血清)封闭缓冲液 (10% 山羊血清)
多聚 HRP 偶联二抗或 HRP 偶联链霉素亲和素多聚 HRP 偶联二抗或 HRP 偶联链霉素亲和素
Alexa Fluor 酪胺试剂Aluora 染料
过氧化氢过氧化氢
反应缓冲液反应缓冲液
反应终止试剂反应终止试剂

注意： Tyramide SuperBoost 试剂盒有两种规格：包括 150 张玻片或 50 张玻片，可采用或不采用与 HRP 偶联的二抗。Aluora 空间扩增试剂盒内含 100 张玻片。

100倍酪胺储备液
试剂名称体积
Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料

全部内容
二甲基亚砜
  • 150 μL，用于 150 张玻片试剂盒规格
  • 100 μL，用于 100 张玻片试剂盒规格
  • 50 μL，用于 50 张玻片试剂盒规格
  1. 将 Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料溶解在 DMSO 中。
  2. 涡旋溶解可能沾在小瓶侧面或瓶盖上的试剂。
  3. 在离心机内短暂脉冲，使内容物下降。

装在密封样品瓶中的 100X 酪胺储备液可在 2 – 8°C 下储存长达 6 个月。 如有可能，将样品瓶避光防潮储存。如需长期保存，可等分至 5-10 μL 容积并保存在 -20°C 下。

100倍过氧化氢溶液
试剂名称体积
过氧化氢溶液1滴
蒸馏 H2O1 mL
  1. 向 1 µL 蒸馏水加入 1 滴 (约 50 μL) 过氧化氢溶液。

注：在使用当天新鲜制备 100倍的 H2O2 溶液。

1倍反应缓冲液
试剂名称体积
反应缓冲液1滴
DDH2O1 mL
  1. 向 1 µL 蒸馏水中加入 1 滴 (约 50 μL) 20倍反应缓冲液。

注：在使用当天新鲜制备1倍反应缓冲液。

反应终止试剂

11倍反应终止试剂储备液

试剂名称体积
反应终止试剂1 瓶
95% 乙醇1.45 mL
  1. 向一瓶反应终止试剂中加入 1.45 mL 95% 乙醇。
  2. 涡旋样品瓶，溶解任何在样品瓶侧面和瓶盖的终止试剂。

注：反应终止试剂储备液的未使用部分可在– 20°C 下储存 6 个月。

反应终止试剂工作溶液

试剂名称体积
11倍反应终止试剂储备液10 μL
PBS100 μL
  1. 在另一根管中，以在 PBS 中稀释 1:11 来制备反应终止剂工作液。

注：在使用当天新鲜制备反应终止试剂工作溶液。

Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料工作液

本表中的 µL 基于 18 mm × 18 mm 盖玻片所需的 100 μL 工作溶液。可根据盖玻片和组织样品的大小调整该体积。

组分盖玻片数 (18 mm × 18 mm)
11050
100倍 Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料储备液1 μL10 μL50 μL
100x H2O2 溶液1 μL10 μL50 μL
1倍反应缓冲液98 μL980 μL4.9 mL

注意： 在使用当天新鲜制备工作溶液。

(可选) 如果执行自发荧光减少

氢氧化钠 (NaOH) 储备液

试剂名称体积
NaOH 溶液 (50% w/w)0.5 mL
去离子水9.5 mL

工作自发荧光淬灭溶液

试剂名称体积
1M NaOH 储备液2.4 mL
H2O2 (30% w/v)15 mL
PBS93.1 mL

注：在磷酸盐缓冲液中的最终浓度应为 24 mM NaOH 和 4.5% H2O2。


制备潮湿的样品室

构建加湿样品室，防止样品干燥。

  1. 湿纸巾，带蒸馏水。
  2. 将湿纸巾铺在玻片容器上。
  3. 铺上封口膜以覆盖湿纸巾。


准备对照品，优化一抗稀释并设置酪胺标记反应

我们强烈建议您在使用试剂盒之前优化一抗。阳性和阴性对照玻片应采用连续稀释法进行染色，包括 1:100、1:500、1:1000、1:5,000、1:10,000。

在许多多重实验中，可以优化一抗浓度，同时使所有抗体保持相同的二抗染色和基于酪胺的反应条件。

Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料工作的孵育期对于获得具有特异性信号的高分辨率图像至关重要。我们强烈建议您在首次进行本实验时，在不同孵育时间点使用阳性和阴性对照玻片优化孵育周期。

要优化该步骤的孵育时间，请使用阳性和阴性对照玻片进行 0、2、5、7 和 10 分钟孵育。

  • 如果阴性对照中存在非特异性信号，或阳性对照中的信号模糊不清，则缩短孵育时间。
  • 如果阳性对照中存在微弱或无信号，则延长孵育时间。

对照玻片

  • 无一抗阴性对照 (省略一抗)。
  • 无一抗或二抗阴性对照 (省略一抗和二抗)。


组织制备

1.根据 标准 IHC/ICC（石蜡）方法去蜡/脱蜡并再水化 FFPE 组织。

2.根据标准抗原修复方法，使用柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0)或 EDTA (pH 9)进行热诱导抗原决定簇修复 (HIER)。
注：自动玻片染色机可用于去蜡/脱蜡和 HIER 步骤。

(可选)在标记前用白光进行自发荧光减少 (方法描述于 Nat Cancer.2023 Jul;4(7):1036-1052）.

3.室温下用1倍 PBS 冲洗样品。

4.将玻片置于覆盖有工作自发荧光溶液 (PBS 中 4.5% 过氧化氢和 24 mM NaOH) 的透明容器中。

5.用白光照亮 60 分钟
注：我们不建议使用紫外光，因为它会破坏某些抗原。

(可选)使用 Image-iT FX 信号增强剂减少非特异性染料结合

6.室温下用1倍 PBS 冲洗样品。

7.每个盖玻片或切片上滴 4 滴或 200 μL 的 Image-iT FX 信号增强剂。

8.在室温下于潮湿环境中培养 30 分钟。

9.室温下用1倍 PBS 冲洗样品。


淬灭内源性过氧化物酶和封闭组织

准备所有试剂，然后开始这些步骤。

淬灭样品的内源性过氧化物酶活性

1.用 3% 过氧化氢溶液覆盖样品。

2.在室温下潮湿环境中培养 60 分钟。

3.室温下用1倍 PBS 冲洗样品。

(可选)如果使用 HRP 结合型链霉亲和素二级，请封闭样品中的内源性生物素。我们建议使用 Invitrogen 内源性生物素封闭试剂盒（货号 E21390)。

4.向细胞或组织中滴一滴或两滴链霉素亲和素试剂，在室温下于潮湿环境中孵育 15-30 分钟。

5.室温下用1倍 PBS 冲洗样品。

6.加入一滴或两滴生物素试剂，在室温下于潮湿环境中孵育 15-30 分钟。

7.室温下用1倍 PBS 冲洗样品。

封闭样品，以进行非特异性结合

8.向样品中加入 2-3 滴 (约 100-150 μL) 封闭缓冲液。

9.在室温下潮湿环境中培养 60 分钟。


使用一抗和多聚 HRP 二抗进行标记

注：如果采用自动玻片染色机进行多通路分析，抗小鼠和抗兔多聚 HRP 偶联的二抗可以 1:1 组合成单一染色溶液。这简化了程序，以便在使用小鼠或兔的一抗染色时可以使用相同的二抗染色溶液。

  1. 用小鼠或兔源的抗体标记组织。在封闭缓冲液中稀释抗体。
    注：我们建议优化一抗染色浓度。
  2. 在室温下与组织一起孵育 30-60 分钟，或在 2–8°C 的潮湿环境中过夜。
    备注：如果使用带有链霉亲和素的试剂盒，请使用生物素偶联的一抗。
  3. 在室温下用1倍 PBS 洗涤组织 2 分钟。重复此步骤三次。
  4. 对于未标记的一抗，向组织中滴加 2-3 滴（约 100-150 µL）与多聚-HRP 相结合的二抗；对于生物素化的一抗，向组织中滴加 2-3 滴（约 100-150 µL）与 HRP 相结合的链霉亲和素。
  5. 在室温下培养 10-60 分钟，或在 2–8°C 下于潮湿环境中培养过夜。
    注：如果您观察到非特异性信号，可以缩短这种孵育周期。
  6. 在室温潮湿环境中的振荡器上用 1X PBS 洗涤组织 2 分钟。重复此步骤三次。


使用荧光基团标记

准备所有试剂，然后开始这些步骤。

在进行之前，可完成 Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料工作溶液和反应终止试剂的孵育期的优化。

用 Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料标记

  1. 将 100 μL Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料工作溶液应用到组织。
  2. 在室温潮湿环境中按照优化时间 (2-10 分钟) 培养。
    可以（1）使用反应终止试剂或（2）通过 HIER 去除抗体来停止反应。我们建议在与一抗一起多重分析时使用 HIER。

    使用终止试剂；建议用于单次反应

  3. 加入 100 µL 反应终止试剂工作溶液。
  4. 在室温下用 1X PBS 冲洗组织三次。
  5. 仅包含生物素-XX 的试剂盒：如果使用含有生物素-XX 的试剂盒，则使用偶联链霉素亲和素。请参阅“推荐用于生物素-XX 检测的链霉素亲和素偶联物”表 (见下文)。
    注：如果将生物素-XX 与荧光链霉亲和素结合使用，请勿在使用链霉亲和素标记后执行 HIER ，因为它也会去除荧光链霉亲和素。

进行抗体去除/剥离 (使用 HIER)；建议当与相同或不同物种的一抗一起进行多通路检测时使用

为了对 FFPE 组织样本进行多重检测，SuperBoost 和 Aluora 空间扩增试剂盒与 Tóth and Mezey (J Histochem， 2007) 描述的柠檬酸盐缓冲液/微波方法兼容， 以去除样品中的一抗和二抗，并消除过氧化物酶活性。该方法不会显著影响共价连接荧光基团的荧光，并允许使用相同或不同物种的其他一抗重新探测组织，然后进行 SuperBoost 或 Aluora 信号放大。

  1. 用蒸馏水以 1:20 稀释柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0)，浓缩液（货号 005000)。
  2. 完成上述“用 Alexa Fluor 酪胺或 Aluora 染料标记”步骤后，将组织放入稀释柠檬酸盐缓冲液 (pH 6.0) 中，并在微波炉中以100%的功率加热，直到煮沸 (1–2.5 分钟)。
  3. 将功率降低至 20% ，并额外微波 15 分钟。
  4. 让组织样品冷却至室温，同时将其保存在柠檬酸盐缓冲液中。
  5. 用 1X PBS 洗涤样品两次。
  6. 重复上面从"封闭样品，以进行非特异性结合"的步骤,以与相同或不同宿主物种的一抗进行非特异性结合。根据需要重复这些步骤，以用于其他靶标。

复染和检测

1.根据需要使用标准方法对组织进行复染。下面是推荐用于核复染的一些试剂。

复染试剂

复染类型产品激发/发射波长 (nm)
即用型核复染剂NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 试剂（货号 R37606）360/460
NucGreen Dead 488 ReadyProbes 试剂（货号 R37109）504/523
NucRed Dead 647 ReadyProbes 试剂（货号 R37113）642/661
浓缩的核复染剂DAPI（货号 D1306）358/461
SYTOX Green（货号 S7020）504/523
SYTOX 深红色染料（货号 S11381）660/682

2.使用具有抗淬灭特性的封片剂封片盖玻片。

3.使用兼容的成像仪器分析组织。


如何选择二抗

信号扩增方法建议使用与多聚-HRP 偶联的二抗，并以全套试剂盒的形式提供。与 HRP 偶联的二抗可能不会提供较佳信号。

生物素-XX 酪胺需要使用表中列出的荧光链霉素亲和素。

链霉素亲和素偶联物建议用于检测生物素-XX 酪胺激发/发射波长 (nm)
Alexa Fluor 350 链霉亲和素（货号 S11249）346/442
Alexa Fluor 405 链霉亲和素（货号 S32351）402/421
Alexa Fluor 488 链霉亲和素（货号 S11223）495/519
Alexa Fluor 514 链霉亲和素（货号 S32353）518/540
Alexa Fluor 555 链霉亲和素（货号 S21381）555/565
Alexa Fluor 594 链霉亲和素（货号 S11227）590/617
Alexa Fluor 647 链霉亲和素（货号 S21374）650/668
Alexa Fluor 680 链霉亲和素（货号 S21378）679/702
Alexa Fluor 700 链霉亲和素（货号 S21383）702/723
Alexa Fluor 750 链霉亲和素（货号 S21384）749/775

参考文献

Lin JR, Chen YA, Campton D, Cooper J, Coy S, Yapp C, Tefft JB, McCarty E, Ligon KL, Rodig SJ, Reese S, George T, Santagata S, Sorger PK.High-plex immunofluorescence imaging and traditional histology of the same tissue section for discovering image-based biomarkers.NATCancer。2023 Jul;4(7):1036-1052. doi: 10.1038/s43018-023-00576-1.PMID: 37349501

PhenoImager 商标为 Akoya Biosciences。BOND 是 Leica Biosystems 及其关联公司的商标。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。

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